劉嘉琳,王海林,全雄志,黃 瀾,馬春梅,張連峰,秦 川
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京100021)
研究報(bào)告
腦組織特異表達(dá)S100B轉(zhuǎn)基因小鼠的建立
劉嘉琳,王海林,全雄志,黃 瀾,馬春梅,張連峰,秦 川
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京100021)
目的 S100B在多種神經(jīng)損傷性疾病中高表達(dá),高濃度的 S100B蛋白對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用。建立腦組織特異表達(dá)S100B轉(zhuǎn)基因小鼠,用于研究該基因在帕金森病(Parkinson's disease,PD)發(fā)病中的作用。方法ELISA法檢測(cè)S100B蛋白在α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)情況。構(gòu)建PDGF-h(huán)S100B表達(dá)載體,顯微注射法建立S100B轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因鼠的基因型,Western blot檢測(cè)基因表達(dá)水平。Rota-rod實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S100B轉(zhuǎn)基因鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。結(jié)果S100B在9月齡和12月齡α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)高于野生型小鼠。建立了2個(gè)品系的腦組織特異表達(dá) S100B轉(zhuǎn)基因小鼠。與野生型小鼠相比 S100B轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明顯的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力障礙。結(jié)論S100B轉(zhuǎn)基因小鼠的建立為研究該基因在PD中的作用提供了工具。
α-synuclein A53T;S100B;小鼠,轉(zhuǎn)基因;腦
S100B蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白,作為腦內(nèi)特異蛋白,主要由星型膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,As)合成,生理狀態(tài)下腦內(nèi)S100B蛋白在胚胎期第14天就有微弱表達(dá),隨后與神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育呈平行增加的關(guān)系,成年后相對(duì)穩(wěn)定。S100B對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是雙向的,生理量的S100B對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、可塑性以及損傷的修復(fù)都是必不可少的。高濃度的 S100B蛋白對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。研究顯示,腦外傷[1]、腦血管病[2]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病[3]以及Down's綜合征、Alzheimer?。?]等神經(jīng)退行性病變病人腦中都可檢出高水平的S100B。S100B可通過受損的血腦屏障進(jìn)入血液,因此,升高的血清 S100B蛋白可作為腦損傷的標(biāo)志。
帕金森病(Parkinson's disease,PD)作為一種嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)退行性疾病,其與S100B之間的關(guān)系國內(nèi)外報(bào)道較少,我們首先在 α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠 PD模型腦組織中檢測(cè)了 S100B蛋白的表達(dá)情況,并進(jìn)一步構(gòu)建了S100B轉(zhuǎn)基因小鼠模型,以研究S100B在PD發(fā)生發(fā)展中的作用。
1.1 ELISA法檢測(cè)S100B在α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)情況
3,6,9,12月齡 α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供提供,動(dòng)物合格證號(hào):GC-08-2014)及陰性對(duì)照各8只,脫頸處死后于冰盤上快速剝離腦組織,稱重后加入一定量的NP-40細(xì)胞組織裂解液(碧云天,P0013F)制成10%的腦組織勻漿,離心20 min(3 000 r/min)取上清進(jìn)行ELISA(試劑盒購自美國RB公司)檢測(cè)。
1.2 S100B轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立
從MGC購買 pOTB7-h(huán)S100B載體(IMAGE: 3543825),通過PCR擴(kuò)增獲得帶有Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)的S100B cDNA目的片段,上游引物為 5′-TTTTAAGCTTCACCATGTCTGAGCTGGAGAAGGC-3′;下游引物為5′-TTTTCTCGAGTTGCATGACCGTCTCT GTTACAG-3′(上海生工公司合成)。反應(yīng)條件為: 94℃ 2 min;94℃ 30 s,62℃ 40 s,72℃ 40 s,共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后克隆到pMD18-T vector,進(jìn)行序列分析(北京三博遠(yuǎn)志公司),把序列正確的S100B基因連入PDGF(由哈佛醫(yī)學(xué)院 Tucker Collins博士惠贈(zèng))啟動(dòng)子下游 Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建腦組織特異表達(dá)S100B的轉(zhuǎn)基因載體,經(jīng)Xba I將表達(dá)載體線性化,獲得 S100B 基因轉(zhuǎn)基因片段。調(diào)整濃度至5 ng/μL,用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中(C57BL/6J小鼠購自康藍(lán)公司),用ICR小鼠作假孕受體(ICR購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000-U顯微注射儀)。
轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后9~14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用堿裂解法提取基因組 DNA,用PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)。上游引物為5′-ATTCTGGAAGGGAGGGAGA-3′;下游引物為5′-GGCAGGCAGTAGTA ACCAT-3′(上海生工公司合成)。反應(yīng)條件為 94℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃30 s,72℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán)。
1.3 Western blot檢測(cè)鑒定S100B蛋白的表達(dá)
提取S100B轉(zhuǎn)基因小鼠F1代和野生型小鼠腦組織總蛋白,BCA法測(cè)定濃度,取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至 PVDF膜上。膜先在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,加入兔抗S100B蛋白抗體(1∶1 0000稀釋,Abcam),4℃雜交過夜。將膜轉(zhuǎn)移到HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶10 000稀釋,Pierce Biotechnology)中,室溫雜交 1 h。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中,曝光、顯影及定影。
1.4 Rota-rod實(shí)驗(yàn)
小鼠分為3月,6月齡組,每組S100B轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型對(duì)照各12只。實(shí)驗(yàn)前,每只小鼠訓(xùn)練5 min,使其能夠在轉(zhuǎn)棒儀上停留,隨后休息2 min開始實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)速為24 r/min,以300 s作為實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間,記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上可停留的時(shí)間。每只小鼠測(cè)試5次,取平均值作為該小鼠Rota-rod實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)。
2.1 S100B蛋白在α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)情況
S100B蛋白在 3月齡和 6月齡 α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)與野生型對(duì)照相比差異無顯著性,而在9月齡和12月齡時(shí)顯著升高(圖1)。
圖1 S100B蛋白在α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)情況(*為P<0.05)Fig.1 The expression of S100B protein in the brain of αsynuclein A53T transgenic mice(* indicates P<0.05)
2.2 PDGF-hS100B表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠的建立
用PCR克隆hS100B cDNA,測(cè)序結(jié)果表明克隆的 cDNA同已報(bào)道的序列完全一致。將 hS100B cDNA插入到 PDGF-鏈啟動(dòng)子下游構(gòu)建 PDGF-h(huán)S100B轉(zhuǎn)基因載體(圖2)。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中,轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中,小鼠出生后9 d提取基因組DNA,用PCR擴(kuò)增S100B目的基因205 bp的片段來檢測(cè)S100B轉(zhuǎn)基因小鼠,共得到5只陽性首建鼠,都可以傳代,分別是Founder2、24、35、36、53 (圖3)。
圖2 PDGF-h(huán)S100B表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 The construction of PDGF-h(huán)S100B vector
圖3 PCR鑒定S100B轉(zhuǎn)基因小鼠的凝膠電泳分析Fig.3 Genotyping of the transgenic mice of S100B with PCR
2.3 S100B蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)
分別提取5個(gè)首建鼠的F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同月齡野生鼠腦組織總蛋白,Western Blot檢測(cè)S100B的表達(dá)。其中founder 2、founder 36首建鼠的F1代轉(zhuǎn)基因陽性小鼠腦組織 S100B表達(dá)量明顯高于野生型和其它founder的小鼠(圖4)。
圖4 S100B在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)Fig.4 The expression of S100B protein in the brain of transgenic mice
2.4 Rota-rod實(shí)驗(yàn)
取3月和6月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照鼠分別進(jìn)行Rota-rod實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)3月齡時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠較陰性對(duì)照小鼠均表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低,在轉(zhuǎn)棒儀上可停留的時(shí)間明顯短于對(duì)照組小鼠。6月齡時(shí)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力下降更加明顯(圖5)。
PD是一種病因不甚明確的神經(jīng)退行性疾病。S100B作為一種腦內(nèi)特異蛋白,研究顯示[5]在 PD病人血液中存在該蛋白的升高。我們利用我所構(gòu)建的人 α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠 PD模型[6]作為研究工具,同樣發(fā)現(xiàn)在9月齡和12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中出現(xiàn)了 S100B蛋白的顯著升高??赡苁请S著病程的進(jìn)展,反應(yīng)性的 As增殖,以及白細(xì)胞介 素-1(interleukin-1,IL-1)、白 細(xì) 胞 介 素-6 (interleukin-6,IL-6)、腫 瘤 壞 死 因 子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等細(xì)胞因子分泌增多,而這些因子都可以進(jìn)一步刺激As的增殖與活化,產(chǎn)生大量的 S100B蛋白[7-8]。
高濃度的S100B蛋白通過①升高神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度引起鈣超載[9];②誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的NO[10];③上調(diào)凋亡相關(guān)基因如c-fos、c-jun、bax、bclx、p15和p21等機(jī)制對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[11]。Himedal等[12]在小鼠腹腔注射 MPTP后,發(fā)現(xiàn)小鼠黑質(zhì)和紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá) S100B的水平與酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性的多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少密切相關(guān)。Debora等[13]根據(jù) H-Y分級(jí)及基本日?;顒?dòng)(activities of daily living,ADL)對(duì)40例PD患者進(jìn)行臨床分期,并檢測(cè)其血液中S100B的含量,發(fā)現(xiàn)血液中S100B的含量與臨床癥狀的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。這些均提示S100B的過多表達(dá)可導(dǎo)致 PD病程的進(jìn)一步發(fā)展。為此,我們構(gòu)建了腦組織特異表達(dá)的 PDGF-h(huán)S100B轉(zhuǎn)基因小鼠,首建鼠 founder 2、founder 24、founder 35、founder 36和founder 53的后代小鼠PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示外源基因能穩(wěn)定地傳遞到下代。Western結(jié)果表明人 S100B基因的表達(dá)量在Founder2和Founder36轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中與野生型相比顯著增高。運(yùn)動(dòng)障礙是PD小鼠的主要行為學(xué)障礙,包括運(yùn)動(dòng)不能、運(yùn)動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)遲緩,Rotarod實(shí)驗(yàn)顯示:3月齡和6月齡S100B轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照組相比可表現(xiàn)出明顯的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力障礙,且隨著年齡的增長,這種差異更加明顯。但我們未發(fā)現(xiàn)免疫組化染色有明顯的TH(+)的多巴胺神經(jīng)元數(shù)量的減少,可能與小鼠的年齡及病程的進(jìn)展有關(guān),需要進(jìn)一步的研究與觀察。
綜上所述,PD時(shí) S100B蛋白含量的升高不僅是腦細(xì)胞損傷的結(jié)果,又是腦細(xì)胞進(jìn)一步損傷的原因之一。S100B轉(zhuǎn)基因小鼠的建立為研究該基因在PD中的作用提供了工具。
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Establishment of Brain-Specific S100B Transgenic Mice
LIU Jia-lin,WANG Hai-lin,QUAN Xiong-zhi,HUANG Lan,MA Chun-mei,ZHANG Lian-feng,QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,and Center of Comparative Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100021,China)
ObjectiveTo establish a brain specific S100B gene transgenic mice and investigate its effect on the development of Parkinson's disease(PD)。MethodsThe expression of S100B protein in the brain of α-synuclein A53T transgenic mice was detected by ELISA.The expression vector of PDGF-h(huán)S100B was constructed.The transgenic mice were produced by microinjection and the genotyping was detected by PCR.The expression levels of the transgenic gene were detected by Western blot.Motor coordination of the S100B transgenic and control mice was detected by Rota-rod test. Results The expression of S100B protein in the brain of 9-and 12-month old α-synuclein A53T transgenic mice was higher than that of the wild type mice.Five founders of brain specific PDGF-h(huán)S100B transgenic mice were established and two high-level expression lines were identified.Compared with the wild type mice,S100B transgenic mice showed apparently progressive decline in motor coordination assessed by Rota-rod test。ConclusionThe transgenic mice with brain specific expression of human S100B gene have been established and it can be used to investigate the function of S100B gene on the development of Parkinson's disease.
α-synuclein A53T;S100B;Mice,Transgenic;Brain;Parkinson's disease
R741
A
1671-7856(2010)
2010-01-05
衛(wèi)生部項(xiàng)目:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專項(xiàng)支持(2009ZX09501-026);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(DWS200808)。
劉嘉琳(1978-),女,博士生,研究方向:老年退行性疾病。
秦川,博士生導(dǎo)師,E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn;張連峰,博士生導(dǎo)師,E-mail:Zhanglf@mail.cnilas.org。