王剛,馬英杰,盧奎
(1.武漢生物工程學院,湖北武漢430415;2.河南工業(yè)大學化學化工學院,河南鄭州450052)
蘇氨酸三肽與DNA相互作用的研究*
王剛1,馬英杰2,盧奎2
(1.武漢生物工程學院,湖北武漢430415;2.河南工業(yè)大學化學化工學院,河南鄭州450052)
利用紫外-可見光譜法和凝膠電泳法研究了在人體正常的生理環(huán)境下蘇氨酸三肽與DNA的相互作用。結果表明:蘇氨酸三肽可與DNA發(fā)生相互作用,二者的作用模式為溝槽結合,結合常數(shù)為K=6.4× 105L·mol-1,最大結合數(shù)n=7.04。
紫外-可見分光光度法;凝膠電泳法;蘇氨酸三肽;DNA;相互作用
脫氧核糖核酸(DNA)是生物體內的重要組成物質,是遺傳信息的主要載體。其與生物的生長、發(fā)育和繁殖等密切相關。小分子可與其發(fā)生相互作用,從而影響人體的生長、發(fā)育和繁殖等,從而小分子可應用于生物醫(yī)藥、功能性食品及生命科學等領域[1,2]。
蘇氨酸是一種重要的營養(yǎng)強化劑,有恢復人體疲勞,促進生長發(fā)育的效果,并且對保護細胞膜起重要作用,在體內能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。其制劑具有促進人體發(fā)育抗脂肪肝藥用效能,是復合氨基酸輸液中的一個成分。因此,由它們形成的寡肽,也應具有巨大的潛在應用價值。并且與氨基酸相比,寡肽的吸收速度和效率更高,且其可由腸道不經(jīng)降解直接吸收[3,4]。由此可以推測蘇氨酸形成的寡肽比蘇氨酸本身更易被人體吸收,其可能具有比蘇氨酸更高的生物活性。
因此,為了研究蘇氨酸寡肽在生物醫(yī)藥、功能性食品及生命科學等領域的潛在應用價值,考察了蘇氨酸三肽(Thr-Thr-Thr)與DNA的相互作用。
1.1 儀器與試劑
UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司);DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠);紫外凝膠成像儀(美國BIO-RAD(伯樂)公司)。
蘇氨酸三肽參照文獻方法制備[5],用二次蒸餾水配成濃度為3.490×10-4mol·L-1的溶液;DNA(A. R.Sigma公司,0~4℃保存,用前未作進一步處理,純度以260 nm與280 nm處吸光度的比值檢測(A260/A280=1.872>1.8,符合實驗要求),利用260 nm處的吸光度確定其濃度(ε=6600 L·(mol·cm)-1)為2.227×10-3mol·L-1;1.0 mol·L-1NaCl溶液;1.0 mol· L-1NaH2PO4溶液;Tris-HCl緩沖溶液(pH值為7.40)。其余試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。
1.2 實驗方法
1.2.1 紫外-可見吸收光譜法研究Thr-Thr-Thr與DNA的相互作用
(1)分別取配好的DNA溶液、Thr-Thr-Thr溶液、NaCl溶液和NaH2PO4溶液各100μL,用Tris-HCl緩沖液稀釋到10mL,用Tris-HCl緩沖液作參比測定200~400nm的紫外吸收光譜。
(2)Thr-Thr-Thr濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中加入相同體積的DNA溶液,一定量的Thr-Thr-Thr溶液,其加入量以一系列Rt(Rt=cThr-Thr-Thr/cDNA,下同)值確定,用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度,混勻,于37℃下放置1 h后,以相應的Thr-Thr-Thr溶液作參比,進行紫外光譜掃描。
(3)作用時間對Thr-Thr-Thr-DNA紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中,在Thr-Thr-Thr-DNA體系中(Rt=2),用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻,于37℃下放置數(shù)小時后,以相應的Thr-Thr-Thr溶液作參比,測定其紫外吸收光譜。
(4)Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10mL比色管中,在Thr-Thr-Thr-DNA體系中(Rt=2),以NaCl調節(jié)離子強度,用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻,于37℃下放置1 h后,以相應的Thr-Thr-Thr溶液作參比,測定其紫外吸收光譜。
(5)PO43-濃度對Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響于一系列10 mL比色管中,在Thr-Thr-Thr-DNA體系中(Rt=2),加入不同濃度的NaH2PO4溶液,用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻,于37℃下放置1 h后,以Thr-Thr-Thr溶液作參比,測定其紫外吸收光譜。
(6)結合常數(shù)的計算采用公式:ΔA-1=(ΔεCL)-1+(ΔεKCL)-1CP-1計算Thr-Thr-Thr與DNA的結合常數(shù)和最大結合數(shù)。
2.2.2 凝膠電泳法研究Thr-Thr-Thr與pUC18DNA相互作用向上樣槽中加入1μL pUC18DNA溶液(0.5μg·μL-1),然后加入不同體積的蘇氨酸三肽溶液(0、1、2、3、4、5、6、7、8和91μL),再加入水,使反應液終體積保持一致,混合均勻。37℃放置1 h后,加入2μL的上樣緩沖液TBE,用質量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠,穩(wěn)壓80 V,電泳60 min,取出凝膠,使用凝膠成像分析系統(tǒng)成像。
2.1 紫外-可見吸收光譜法
2.1.1 DNA、蘇氨酸三肽(Thr-Thr-Thr)溶液紫外吸收光譜的測定(圖1)
圖1DNA與Thr-Thr-Thr的紫外吸收光譜Fig.1The UV-Vis absorption spectroscopy of DNA and Thr-Thr-Thr(a.DNA b.Thr-Thr-Thr)
對DNA進行紫外光譜掃描,發(fā)現(xiàn)其在λ=260nm有最大吸收;Thr-Thr-Thr在260nm附近也有紫外吸收,因此,在紫外光譜法研究Thr-Thr-Thr濃度對Ph-DNA紫外吸收影響時,須用相應的Thr-Thr-Thr溶液作參比,以扣除Thr-Thr-Thr在λ=260nm處的吸收。
2.1.2 蘇氨酸三肽(Thr-Thr-Thr)濃度對DNA紫外光譜的影響(圖2)
圖2Thr-Thr-Thr濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外吸收光譜的影響Fig.2UV-Vis absorption spectra of different concentration of Thr-Thr-Thr interacted with DNA
由圖2可知,在Thr-Thr-Thr-DNA體系中,隨著Thr-Thr-Thr的濃度不斷增加,DNA分子在260nm處的紫外吸收呈增色效應。在Rt值為0~2階段,增色效應較為明顯,增色率較大;在Rt值為2~6階段,增色率不大。
增色效應可能是Thr-Thr-Thr以氫鍵作用或范德華力的方式與DNA的大溝或小溝的堿基邊緣直接發(fā)生相互作用,破壞了DNA的雙螺旋而產生的。DNA的堿基是紫外光譜的生色團。在正常情況下,DNA的堿基是被包裹在DNA磷酸骨架內部的。磷酸骨架的存在,減弱了堿基的紫外吸收。當有外在的物質與DNA發(fā)生作用時,外在物質破壞了DNA分子的雙螺旋結構,使得堿基從嚴密的包裹狀態(tài)下,暴露出來。這將使得DNA的紫外吸收明顯的增加[6]。
然而,在本文中Thr-Thr-Thr的加入會使得DNA的紫外吸收發(fā)生增色效應,但增色率不大(在Rt值0~6范圍內,約為:8.8%)。這說明可能是Thr-Thr-Thr以溝槽作用的方式與DNA的堿基發(fā)生作用,有限度的改變了DNA的雙螺旋結構,但沒有從根本上破壞DNA的雙螺旋。
2.1.3 作用時間對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響(圖3)
圖3 時間對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.3UV-Vis absorption spectra of different interaction time of Thr-Thr-Thr interacted with DNA
隨著時間的延長,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生增色效應。在6h內,增色效應較為明顯,增色率達到了15.3%;而在其后的8h內,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收的增色效應不明顯,增色率僅為2.7%。
可能的原因是:Thr-Thr-Thr與DNA發(fā)生相互作用是動態(tài)的,二者之間的相互作用要達到動態(tài)的平衡是需要一定時間的。這個時間可能就是6h。經(jīng)過6h,Thr-Thr-Thr與DNA的相互作用達到了平衡狀態(tài),此時Thr-Thr-Thr-DNA體系也就達到了穩(wěn)定的狀態(tài),體系的紫外吸收也達到了一個較為穩(wěn)定的值。此后,再延長時間,也不會對Thr-Thr-Thr-DNA體系產生影響。因此,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收也就保持基本恒定。
2.1.4 體系Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響(圖4)
圖4Na+強度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.4Effect of salinity on the UV-Vis absorption spectra of Thr-Thr-Thr interaction with DNA
由圖4可知,在0~160mmol·L-1的Na+濃度范圍內,隨著Na+濃度的增加,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生一定的增色效應,增色的幅度約為6.3%;當Na+濃度從160mmol·L-1增加到200mmol· L-1,Thr-Thr-Thr-DNA體系的體系的紫外吸收有一定程度的降低,降幅約為3%。
以上現(xiàn)象的原因可能是Thr-Thr-Thr使得DNA的立體構象發(fā)生改變,當然Na+濃度會維持并稍稍加大這一改變。這就使得Thr-Thr-Thr-DNA體系的體系的紫外吸收有一定的增色效應;但當Na+濃度增加到一定程度時(160 mmol·L-1),由于Na+與DNA的磷酸骨架作用,中和其上所帶的正電荷,使得DNA分子因Thr-Thr-Thr的作用而發(fā)生的構象改變,有一定程度的恢復。這時,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收,有一定程度的減弱。
但是從整體上看,Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收在所選的Na+濃度范圍內,雖有一定的變化,但是變化不是很顯著。這說明,人體正常的Na+濃度范圍內,Thr-Thr-Thr-DNA體系的處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。
2.1.5 體系PO43-濃度對Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響(圖5)
圖5PO43-濃度對Thr-Thr-Thr-DNA體系紫外光譜的影響Fig.5Effect of PO43-on the UV-Vis absorption spectra of Thr-Thr-Thr interaction with DNA
PO43-的加入,會使得Thr-Thr-Thr-DNA體系的紫外吸收發(fā)生一定的波動。其中當PO43-的濃度為0.8m mol·L-1時,體系的紫外吸收有一極小值(0.385)。然后,隨著PO43-濃度逐漸增加,體系的紫外吸收又緩慢的增加。從圖5可以看出,體系紫外吸收的波動是在一個較小的范圍內進行的,即在所選PO43-濃度范圍內,對Thr-Thr-Thr-DNA體系來說,外在環(huán)境的影響是相對較小的。
2.1.6 結合常數(shù)的計算設游離態(tài)與結合態(tài)DNA的總濃度分別為[L]與[L′],DNA的分析濃度為CL(CL=[L]+[L′]),則溶液的吸光度可表示為[7]:
式中ε,ε′:分別表示游離與結合態(tài)DNA的平均摩爾吸光系數(shù),εCL:DNA空白溶液的吸光度。令:
則由式(1)可得
△ε在測量條件和溶液酸度一定時為定值。
假定在溶液中反應符合以下關系:
式中CP:氨基酸寡肽的分析濃度;K:表觀結合常數(shù)。
將式(4)及關系式[L]=CL-[L′]代入上式得:
上式兩端同時除以KCPCLΔA,移項,得
根據(jù)上式,若在實驗中固定CL,改變CP,則△A-1與CP-1呈線性關系,由回歸直線的截距與斜率可得Δε,K。在求得K之后,可根據(jù)n=KCL的關系計算最大結合數(shù)n。
表1 不同濃度的Thr-Thr-Thr對應的DNA在260nm處吸光值變化Tab.1Values of ΔA at different concentration of Thr-Thr-Thr
表2 ΔA-1與Cp-1關系表Tab.2Relationships between ΔA-1and C-1p
圖6 ΔA-1與Cp-1關系的關系圖Fig.6Relationships between ΔA-1and Cp-1
線性回歸方程為:y=2.788×10-4x+179.1,R2= 0.8615,相關系數(shù)R=0.93。(ΔεCL)-1=179.1,(ΔεKCL)-1=2.788×10-4。根據(jù)式(6)可求出結合常數(shù)K=6.4×105L·mol-1,最大結合數(shù)n=7.04。
2.2 凝膠電泳法
為了檢驗Thr-Thr-Thr是否嚴重的破壞了DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳分析Thr-Thr-Thr與pUC18DNA的相互作用。若電泳后,出現(xiàn)不同遷移率的pUC18DNA,則說明Thr-Thr-Thr嚴重的破壞了DNA的結構,使得DNA開環(huán)或出現(xiàn)缺口[8]。
圖7是含不同濃度Thr-Thr-Thr的DNA溶液的電泳圖。
圖7 含不同濃度Thr-Thr-Thr的DNA溶液的電泳圖Fig.7Electrophoretogram of different concentration of Thr-Thr-Thr interacted with DNA
從圖7可看出,加入不同濃度Thr-Thr-Thr(1至8泳道,Thr-Thr-Thr濃度不斷增加)的DNA的遷移率基本一致。不同濃度的Thr-Thr-Thr并沒有使得DNA斷裂。這說明了不同濃度Thr-Thr-Thr對DNA的結構可能有破壞作用,但并不使DNA斷裂。這與紫外光譜法得到的結論是相符的。
本文通過紫外光譜法和凝膠電泳法研究了蘇氨酸三肽與DNA的相互作用,考察了蘇氨酸三肽濃度、時間、Na+強度和PO34-濃度對二者相互作用的影響,通過實驗現(xiàn)象綜合分析得到蘇氨酸三肽是以溝槽的模式與DNA相互作用的。并計算得到了二者結合常數(shù)和最大結合數(shù)。
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Study on interaction of threonine-tripeptide and DNA*
WANG Gang1,MA Ying-jie2,LU Kui2
(1.Wuhan Bioengineering Instituge,Wuhan 430415,China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Zhengzhou 450052,China)
The interaction betweenThr-Thr-Thr and DNA was studied by UV-Vis spectrophotometry and gel electrophoresis method in the physiological environment of human’s.The results showed that there was an interaction between Thr-Thr-Thr and DNA.The action model might be groove combination.The Binding Constant(K=6.4×105L·mol-1)and the maximum binding number(n=7.04)were obtained.
UV-Vis spectrophotometry;gel electrophoresis method;threonine-tripeptide;DNA;interaction
book=2010,ebook=267
O657.3
A
1002-1124(2010)11-0007-05
2010-09-06
國家自然科學基金資助項目(NO.20572016,NO.20772023);河南省教育廳科技計劃資助項目(NO.2006KYCX017)
王剛(1982-),男,武漢市人,實驗師,本科。