劉金鵬 鄧春艷 齊 暉 李富榮 (暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院臨研中心,深圳518020)

體外DCs在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受中的作用機(jī)制①

劉金鵬 鄧春艷 齊 暉 李富榮 (暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院臨研中心,深圳518020)

目的:探討樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受中所發(fā)揮的作用,從而闡明抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。方法:采用DCs的常規(guī)誘導(dǎo)方法(rmG M-CSF、IL-4和LPS),在誘導(dǎo)過(guò)程中加入不同劑量的抗CD45RB抗體,成熟后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型、周期和吞噬能力,ELISA法檢測(cè)IL-12分泌量,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)DCs對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果:DCs經(jīng)抗CD45RB抗體處理后,CD11C和CD83表達(dá)升高,CD86表達(dá)下降,自身增殖和吞噬能力增強(qiáng),但分泌IL-12和刺激T細(xì)胞增殖的能力明顯下降。結(jié)論:耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)能顯著抑制T細(xì)胞的增殖,它的產(chǎn)生是抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受的主要機(jī)制之一。

抗CD45RB抗體;樹(shù)突狀細(xì)胞;免疫耐受

目前已有大量實(shí)驗(yàn)證明,抗CD45RB抗體能夠在同種異體移植模型中誘導(dǎo)移植物長(zhǎng)期存活,并在受體體內(nèi)形成特異性的免疫耐受[1-3],Deng等[4]還發(fā)現(xiàn)抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的耐受狀態(tài)有其特殊性,它需要受體B淋巴細(xì)胞和完整的胸腺,胸腺來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞將耐受從胸腺轉(zhuǎn)向外周,而DCs在T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育、分化中,以及記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞的形成和維持中發(fā)揮著重要的作用,那么抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受體系中DCs有何作用,目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就DCs在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受中如何發(fā)揮作用,利用在骨髓細(xì)胞來(lái)源DCs的分化中加入不同劑量的抗CD45RB抗體,觀察抗CD45RB抗體對(duì)BMC來(lái)源mDCs在形態(tài)、表型、細(xì)胞周期、吞噬能力以及分泌IL-12能力上的變化,再通過(guò)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系模擬同種異體移植排斥反應(yīng)來(lái)分析mDCs的免疫學(xué)功能,以闡明DCs在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受中的作用,為抗CD45RB抗體的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué),6～8周雄性BALB/c小鼠購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,均飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 DCs的誘導(dǎo) 無(wú)菌提取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨,用RPMI1640培養(yǎng)基(Thermo,America)沖出髓腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞,然后用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞,加入完全培養(yǎng)基(含10%fetal calf serum, rmG M-CSF和IL-4各10 ng/ml,PeproTech,USA),細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,37℃,5%CO2培養(yǎng)2天后棄懸浮細(xì)胞,加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);第4天半量換液,加刺激劑LPS 1μg/ml(Sigma,USA),第6天收獲mDCs為對(duì)照組;在完全培養(yǎng)基里分別添加不同劑量的抗CD45RB抗體(5、10、20和40μg/ml,克隆號(hào): Cat.#BE0019,BioXcell,Lebanon)收獲的mDCs為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 mDCs表型的檢測(cè) 收獲各組mDCs,將其濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml,分別取100μl細(xì)胞懸液,加入FITC(Fluorescein isothiocyanate)-CD11C和 FITC-I-Ab (BD Pharmingen,America),PE(phycoerythrin)-CD83和PE-CD86(eBioscience,USA)及相應(yīng)的 Isotype,37℃避光孵育15～20分鐘,流式細(xì)胞儀(Epics ALTRA型, American)檢測(cè)其細(xì)胞表型。

1.4 mDCs細(xì)胞周期檢測(cè) 將各組mDCs細(xì)胞懸液移入離心管,1 200 r/min離心5分鐘,棄上清,用PBS洗滌細(xì)胞兩遍,然后用70%乙醇固定細(xì)胞,4℃過(guò)夜;用PBS洗滌2次后用0.4 ml PBS重懸,加入RNase-A 20μl(1mg/ml,G ibco,America)37℃作用30分鐘,再加入碘化丙啶 50μl(0.5 mg/ml,Sigma, America)中,避光冰浴30分鐘后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)以multicycle analysis軟件分析。

1.5 mDCs吞噬抗原能力的檢測(cè) 將各組mDCs用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸,取5×105個(gè)細(xì)胞,加入FITC-Dextran至終濃度1 mg/ml(Molecular Probs,America),混勻后分為兩管,一管置于4℃作為空白對(duì)照,另一管置于37℃檢測(cè)內(nèi)吞能力,孵育2小時(shí)后用冰PBS液洗滌2次,流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)表示DCs攝取Dextran的能力。DCs內(nèi)吞量=DCs內(nèi)吞平均熒光強(qiáng)度-DCs對(duì)照平均熒光強(qiáng)度。

1.6 mDCs分泌IL-12的檢測(cè) 取各組mDCs的培養(yǎng)上清液,小鼠IL-12 ELISA試劑盒(Biosource,American)檢測(cè)分泌IL-12的含量。

1.7 DCs和T細(xì)胞的分選 將各組mDCs和BALB/c小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液,用全DC細(xì)胞磁珠和T細(xì)胞免疫磁珠(Miltenyi Biotec,Germany)分選DCs和T淋巴細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。

1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MRL) mDCs經(jīng)絲裂霉素處理后作為刺激細(xì)胞,按4×104個(gè)/孔加入96孔板,再加入提取的T細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)作為反應(yīng)細(xì)胞,對(duì)照組則只加入BALB/c小鼠T細(xì)胞(2×105個(gè)/孔),然后補(bǔ)加10%FBS的RPMI1640至每孔終體積200μl,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天,然后用CCK-8 ELISA試劑盒(DojinDo,Japan)檢測(cè)各組的吸光度(OD值)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有結(jié)果以 x—±s表示,采用方差分析或 t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCs形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)至第2天,細(xì)胞開(kāi)始分為懸浮和貼壁兩種狀態(tài),聚集成簇,大部分細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,少量細(xì)胞已有毛刺出現(xiàn);培養(yǎng)至第4天細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增多,懸浮和貼壁細(xì)胞的比例為1∶1左右,體積較大且形態(tài)不均,大部分細(xì)胞已有毛刺樣突起;第6天,細(xì)胞的毛刺樣突起更加明顯(圖1),但是鏡下對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的mDCs細(xì)胞在形態(tài)和數(shù)量上無(wú)明顯差別。

圖1 DCs的毛刺樣突起更為明顯(×200)Fig.1 The dendritic projections were more obviously(×200)

圖2 不同劑量的抗CD45RB抗體對(duì)DCs表型的影響Fig.2 Effect of different dosage of anti-CD45RB monoclonal antibody on the phenotype of DCs

2.2 mDCs表型的檢測(cè) 檢測(cè)mDCs表面的主要表型(CD11C、CD83、CD86和I-Ab),結(jié)果如圖2,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組加入各劑量抗CD45RB抗體的mDCs表面CD11C表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05),而10μg/ml劑量組CD11C的表達(dá)明顯高于其它各劑量組(P<0.05)。CD83表達(dá)結(jié)果類似,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P< 0.05),實(shí)驗(yàn)組中的10μg/ml劑量組CD83的表達(dá)最高(P<0.05),5μg/ml和20μg/ml劑量組間CD83的表達(dá)無(wú)差異(P>0.05),但均高于40μg/ml組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中CD86的表達(dá)要顯著低于對(duì)照組 (P<0.05),且實(shí)驗(yàn)組中的20μg/ml和40μg/ml劑量組低于5μg/ml和10μg/ml劑量組(P<0.05)。I-Ab的表達(dá)不受加入抗體劑量的影響,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)。

2.3 mDCs細(xì)胞周期檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組處于G2-M期的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.01),但是實(shí)驗(yàn)組中的5、10和20μg/ml三個(gè)劑量組之間處于G2-M期的細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05,圖3)。

2.4 mDCs攝取抗原能力的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組中5、10和20 μg/ml三個(gè)劑量組的抗原吞噬能力無(wú)差異(P>0.05),但與對(duì)照組相比,三個(gè)劑量組的抗原吞噬能力為對(duì)照組的6～8倍(圖4),具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 DCs細(xì)胞周期的檢測(cè)Fig.3 Determine of cycle of DCs

圖4 DCs抗原攝取能力的檢測(cè)Fig.4 Determine of phagocytic function of DCs

2.5 mDCs分泌IL-12水平 實(shí)驗(yàn)組IL-12分泌量明顯低于對(duì)照組(P<0.01),實(shí)驗(yàn)組中5、10和20μg/ml三個(gè)劑量組IL-12的分泌量依次降低,且存在顯著性差異(P<0.01),20μg/ml劑量組的IL-12分泌量只有對(duì)照組的1/3(圖5),說(shuō)明抗體加入量與mDCs分泌IL-12的能力呈明顯的負(fù)相關(guān)性。

2.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)分為三組:①mDCs+ T;②DCs(10μg)+T;③單獨(dú)T細(xì)胞組(設(shè)零組)。結(jié)果如圖6,①組的OD值明顯大于②組(P<0.01),說(shuō)明經(jīng)抗CD45RB抗體處理后的DCs具有明顯抑制T增殖的能力。

3 討論

圖5 各組上清液IL-12的含量(pg/ml)Fig.5 IL-12 activity in the supernatant of different groups (pg/ml)

圖6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)Fig.6 Mixed lymphocyte reaction

以往認(rèn)為DCs是激活T細(xì)胞初始免疫反應(yīng)的細(xì)胞,隨著人們認(rèn)識(shí)逐漸深入,發(fā)現(xiàn)DCs參與免疫耐受的誘導(dǎo),并提出tDCs這一概念。tDCs具有以下幾種特性:①表面缺乏免疫應(yīng)答所必需的CD40、CD80和CD86等共刺激分子,不能有效遞呈抗原和激活T細(xì)胞,導(dǎo)致免疫耐受;②能夠誘導(dǎo)外周T細(xì)胞的無(wú)能或低能反應(yīng),并激活T細(xì)胞凋亡;③誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator T cell,Treg cell)和Th2細(xì)胞的產(chǎn)生,從而引起特異性免疫耐受。而抗CD45RB抗體在體外誘導(dǎo)的免疫耐受可能與tDCs有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)抗CD45RB抗體處理后,mDCs表面共刺激分子CD86的表達(dá)下降,而且mDCs的特異性標(biāo)記CD11C和成熟標(biāo)記CD83表達(dá)升高。CD86的表達(dá)下降說(shuō)明mDCs遞呈抗原和激活 T細(xì)胞的能力降低[5]。而CD11C表達(dá)升高可能是抗CD45RB抗體增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)積累,使更多mDCs進(jìn)入分裂期。CD83升高說(shuō)明mDCs可能與胸腺中T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用得到了加強(qiáng),因?yàn)镃D83分子和其分泌的可溶性CD83分子可與胸腺中T細(xì)胞和B細(xì)胞表面的CD83配體結(jié)合,使T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育和分化受到影響[6-9]。一些學(xué)者報(bào)道CD83表達(dá)升高不影響mDCs刺激T細(xì)胞增殖能力,但可引起可溶性CD83分子的增多[10,11]?？扇苄訡D83分子可使T細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制使其移植物的長(zhǎng)期存活[12,13]。由此可見(jiàn),經(jīng)抗CD45RB抗體處理后,mDCs不但激活T細(xì)胞的能力受到抑制,而且自身數(shù)量以及分泌的耐受性可溶性CD83分子增多,將有利于機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生。

目前研究認(rèn)為,DCs之所以能夠?qū)е旅庖吣褪艿陌l(fā)生,還依賴于它本身具有一些未成熟階段的生物學(xué)功能,如吞噬抗原能力增強(qiáng)和分泌IL-12能力下降等。對(duì)Ab-mDCs的功能經(jīng)Dextran內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)和IL-12含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),抗CD45RB抗體能夠使實(shí)驗(yàn)組mDCs的抗原吞噬能力顯著增強(qiáng),而IL-12分泌能力受到顯著抑制。IL-12作為DCs抗原提呈和活化T細(xì)胞過(guò)程中最為重要的細(xì)胞因子[14],它的減少使初始T細(xì)胞更易向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化,引起IFN-γ分泌減少、IL-10分泌增加,進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞“無(wú)反應(yīng)”和免疫耐受的發(fā)生。

IL-4是促使DCs成熟的生長(zhǎng)因子,如果在DCs的誘導(dǎo)過(guò)程中不添加IL-4,就會(huì)誘導(dǎo)出具有免疫耐受性的DCs,它能夠抑制同種異體移植物的排斥,引起免疫耐受的形成。而本實(shí)驗(yàn)中加入了IL-4促使DC成熟,所以誘導(dǎo)的mDCs能夠刺激T淋巴細(xì)胞增殖,由于實(shí)驗(yàn)組又添加了抗CD45RB抗體,結(jié)果mDCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯受到抑制,這就說(shuō)明抗CD45RB抗體可以使mDCs獲得免疫耐受性。

綜上所述,抗CD45RB抗體能夠成功的誘導(dǎo)出一種tDCs,它具有顯著抑制T細(xì)胞增殖的能力。但tDCs是否可以引起移植物的長(zhǎng)期存活,以及耐受動(dòng)物體內(nèi)是否存在這種tDCs,還有待進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究證實(shí)。

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[收稿2009-10-09 修回2009-11-16]

(編輯 倪 鵬)

The role of DC in anti-CD45RB antibody-induced immune tolerance

LIU Jin-Peng,DENG Chun-Yan,QI Hui,LI Fu-Rong.Clinical Research Center,Shenzhen People’s Hospital,the Second Medical College of University of Jinan,Shenzhen518020,China

Objective:T o investigate the role of dendritic cells(DCs)in the anti-CD45RB antibody-induced immune tolerance,and the mechanism of immune tolerance induced by anti-CD45RB antibodies.Methods:DCs were induced by conventional methods(rmG M-CSF,IL-4 andLPS),different dosesof anti-CD45RB antibodieswere added in the induction process.Then,mature cellswere harvested,andflow cytometry (FCM)was used to determine cell phenotypes,cycle and phagocytosis,ELISA method was performed to examine the concentration of IL-12 and the ability of T cell proliferation was observed by mixed lymphocyte culture.Results:The DCs preparation was shown a high expression of CD11C and CD83,a low expression of CD86,with strong proliferative and phagocytic capacity after treated with anti-CD45RB antibody.Its secretion of IL-12 was decreased,and it could less effectively stimulate T cell proliferation after treated with anti-CD45RB antibody.Conclusion: One of the mechanismsof anti-CD45RB monoclonal antibody-induced tolerance is to generate tolerogenic dendritic cells(tDCs),significantly inhibiting the proliferation of T cells.

Anti-CD45RB antibody;Dendritic cell;Immune tolerance

R392.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0113-04

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30772042)

劉金鵬(1982年-),男,在讀碩士,主要從事干細(xì)胞與組織工程研究,E-mail:lekai0822@163.com;

及指導(dǎo)教師:李富榮(1962年-),男,博士,研究員,主要從事干細(xì)胞和細(xì)胞移植方面的研究,E-mail:frli62@ yahoo.com。