王家鳳 張志民 王成坤 聶代邦 高文信

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部 動物技術(shù)系，吉林 長春 130062）

X-性染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）參與了多種惡性腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)化，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、預(yù)后以及化療耐藥密切相關(guān)[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌是頜面部常見的腫瘤之一，本研究旨在探討XIAP在人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，并分析XIAP表達(dá)與Tca8113細(xì)胞化療耐藥之間的關(guān)系，為腫瘤的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞（由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所提供），IMDM培養(yǎng)基、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（長春寶泰克公司），平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院藥房），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR）試劑盒、PCR-marker、DNA回收試劑盒、T載體（Takara公司，日本），XIAP引物合成送至長春寶泰克公司完成。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理方法

在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞。取對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入PYM，使其終濃度為0.5 μg·mL-1，用該藥物作用72 h，棄去含PYM的培養(yǎng)液，再用正常培養(yǎng)液沖洗3次，然后加入新鮮正常培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長，重復(fù)上述步驟1次后，將藥物濃度提高1倍進(jìn)入下1個(gè)培養(yǎng)周期。重復(fù)以上步驟，直到Tca8113細(xì)胞能夠維持在藥物濃度分別為1、10 μg·mL-1的培養(yǎng)液中正常生長，而成為耐藥Tca8113細(xì)胞，命名為Tca8113-1、Tca8113-10。耐藥細(xì)胞模型建立后，將這2種細(xì)胞在各自的藥物濃度下分別培養(yǎng)10、20 d，分別為Tca8113-1-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-10組、Tca8113-10-20組。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞對PYM的敏感性

將Tca8113-1-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-10組、Tca8113-10-20組和未加藥物處理的Tca8113組細(xì)胞分別以每孔1×104個(gè)接種于96孔板，各孔加入不同濃度的PYM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，濃度分別為1 000、100、10、1、0.1 μg·mL-1，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。3 d后每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μg，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，吸干培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）150 μL，室溫?fù)u床上混勻10 min后，在490 nm波長下測各孔的光密度值（A值）。實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)5次，將細(xì)胞密度的對數(shù)與細(xì)胞抑制率作半對數(shù)曲線，根據(jù)趨勢公式計(jì)算出藥物半數(shù)有效濃度（IC50）。

1.4 RT-PCR法檢測XIAP mRNA的表達(dá)水平

細(xì)胞RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄按一步法RT-PCR試劑盒的說明書進(jìn)行。XIAP的上游引物序列為：5′-AGAACAGAAGGGACAAGAATA-3′；下游引物序列為：5′-CACAAGGAACAAAAACGATAG-3′，擴(kuò)增長度為524 bp。β-actin上游引物序列為：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物序列為：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，擴(kuò)增長度為204 bp。反應(yīng)完畢后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠分析系統(tǒng)分析并照相，用Quanity one圖像分析系統(tǒng)測光密度值進(jìn)行半定量。實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)5次。1.4.1 PCR產(chǎn)物的檢測 PCR產(chǎn)物用2%水平瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，進(jìn)行光密度值掃描，得到XIAP各擴(kuò)增帶光密度值和面積值，然后用其表達(dá)量與對應(yīng)的β-actin表達(dá)量的比值進(jìn)行比較。1.4.2 PCR產(chǎn)物的測序 PCR產(chǎn)物用2%水平瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用刀片將擴(kuò)增帶割下，按照DNA回收試劑盒的說明書將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物回收。將回收后的目的DNA連接至T載體上，按照T載體說明書標(biāo)識的方法操作，送至長春寶泰克公司測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有計(jì)數(shù)資料的比較均采用方差分析，藥物與IC50相對量之間的關(guān)系采用直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測結(jié)果

在各濃度PYM作用下，各耐藥組細(xì)胞抑制率明顯低于Tca8113細(xì)胞組（P＜0.05），說明各耐藥組細(xì)胞對PYM有明顯抗藥性。Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組耐藥細(xì)胞對PYM的IC50分別為（12.758±0.030）、（18.986±0.150）μg·mL-1，二者與Tca8113細(xì)胞組IC50（6.414 μg·mL-1±0.059 μg·mL-1）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組耐藥細(xì)胞對PYM的IC50分別為（26.302±0.072）、（35.294±0.115）μg·mL-1，二者與Tca8113細(xì)胞組IC50比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖 1 各組細(xì)胞的電泳結(jié)果Fig 1 The electrophoresis results of every group

圖像經(jīng)分析系統(tǒng)分析，測得XIAP和β-actin的光密度值和面積值，計(jì)算Tca8113細(xì)胞組、Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組結(jié)果分別為0.324、0.401、0.695、0.898、1.096。結(jié)果表明，XIAP對細(xì)胞耐藥有影響，并且有濃度和時(shí)間依賴性，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，XIAP mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，XIAP mRNA的表達(dá)水平與耐藥株耐藥時(shí)間呈明顯正相關(guān)（P＜0.01），Tca8113-10-20組表達(dá)最強(qiáng)。以XIAP mRNA的相對含量為自變量（X），IC50為因變量（Y），建立方程為：Y=-3.421+34.326X。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明XIAP的表達(dá)水平與Tca8113細(xì)胞對PYM的耐藥性呈正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論

細(xì)胞凋亡程序失調(diào)能導(dǎo)致許多疾病，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、抗藥、神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病，XIAP是參與細(xì)胞凋亡機(jī)制的主要因子[2]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族是至今發(fā)現(xiàn)的哺乳類細(xì)胞中唯一的內(nèi)源性半胱天冬酶（caspase）抑制物，能有效阻止細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，XIAP是IAP家族中對caspase抑制作用最強(qiáng)的成員，可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：XIAP通過N-端的3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9活性，或通過C端的RING鋅指結(jié)構(gòu)域催化caspase泛素化降解[3]。

目前頭頸部惡性腫瘤的治療方法仍是以外科手術(shù)配合化療和放療的綜合治療為主，而耐藥又是化療失敗的主要原因。探討腫瘤產(chǎn)生耐藥的原因、分子機(jī)制以及如何抵抗腫瘤的耐藥性以提高化療的效果和降低藥物的毒副作用是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域急需解決的問題。XIAP在口腔鱗癌組織中呈高表達(dá)，XIAP可能與腫瘤的化療耐藥有關(guān)[4]。為此本研究選擇了可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的Tca8113細(xì)胞為研究對象，采用了間歇性加藥、逐步遞增劑量、體外連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性[5]，并運(yùn)用RT-PCR檢測不同耐藥劑量和時(shí)間誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞中XIAP的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示在Tca8113細(xì)胞中XIAP呈高水平表達(dá)；Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組細(xì)胞的IC50有所升高，Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組細(xì)胞IC50升高明顯，這與馮戈等[6]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，隨著化療藥物培養(yǎng)時(shí)間的延長及藥物濃度的增加，細(xì)胞對化療藥物的耐藥性逐漸增加，同樣XIAP的表達(dá)水平也隨之增加，且與時(shí)間的關(guān)系最為密切；直線相關(guān)分析提示XIAP的表達(dá)水平與Tca8113細(xì)胞對PYM的耐藥性呈正相關(guān)。有研究[7-8]采用siRNA或反義寡核苷酸技術(shù)下調(diào)XIAP的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞恢復(fù)了對藥物的敏感性。因此，認(rèn)為Tca8113細(xì)胞中XIAP表達(dá)水平的升高是在化療藥物的誘導(dǎo)下出現(xiàn)的，升高的XIAP進(jìn)而參與了細(xì)胞繼發(fā)性耐藥性的產(chǎn)生，然而基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制是極其復(fù)雜的，XIAP在藥物作用下表達(dá)的變化具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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