吳益華（上海第二工業(yè)大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201209）

血紅蛋白固定在Ti0.865O2納米片層間的直接電化學(xué)和電催化

吳益華
（上海第二工業(yè)大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201209）

通過對層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀進行剝離，可以制備得到Ti0.865O2納米片溶膠。將Ti0.865O2納米片作為載體固定血紅蛋白（Hb），制備得到Hb/Ti0.865O2/納米片修飾的熱解石墨（PG）電極。在Ti0.865O2納米片層間，Hb能實現(xiàn)與電極的直接電子轉(zhuǎn)移。在pH值為5.6的磷酸鹽緩沖溶液中，該修飾電極的循環(huán)伏安曲線上顯示出一對可逆的氧化還原峰，式電位為－230 mV (vs.Ag/AgCl)。該修飾電極對H2O2有良好的電催化響應(yīng)，線性響應(yīng)范圍為50 μM到2.2 mM，靈敏度為10 uA·mM-1·cm-2。

血紅蛋白；雙氧水；直接電化學(xué)；電催化

0 前言

生物傳感器是一種以生物活性物質(zhì)（如酶、抗體、核酸、細胞等）為敏感基元，通過將其固定在信號轉(zhuǎn)換器上構(gòu)成生物轉(zhuǎn)化器，把生物化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的物理化學(xué)信號的儀器[1]。生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低等特點，在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)藥與軍事醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值，已引起世界各國極大的關(guān)注[2－5]。遺憾的是，在生物傳感器中，蛋白質(zhì)在電極表面通常易被吸附，可能造成構(gòu)像變化和喪失活性，從而使得蛋白質(zhì)在電極表面的電子傳遞能力受到抑制。因此，要實現(xiàn)這些缺乏長程電子通道蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移，需要采取一些特定的方法來達到如下目的：1）蛋白質(zhì)的活性中心盡可能地接近電極表面；2）使蛋白質(zhì)分子適當變形但不失活；3）使電極表面與蛋白質(zhì)分子充分接觸；4）通過修飾電極打開電子通道。一個比較有效的方法就是用適當?shù)牟牧瞎潭ǖ鞍踪|(zhì)于電極上，從而促進蛋白質(zhì)與電極的直接電子傳遞[6－8]。

很多材料，如聚合物膜[9]、納米材料[10－11]、表面活性劑[12－13]、類脂膜[14]等都被用于固定蛋白質(zhì)以制造生物傳感器。納米結(jié)構(gòu)的氧化鈦材料也被廣泛用于固定蛋白質(zhì)制造生物傳感器。氧化鈦納米材料具有高比表面積、強吸附能力、良好的生物相容性以及優(yōu)異的熱和化學(xué)穩(wěn)定性等一系列優(yōu)良特性。許多課題組都報道了利用各種納米結(jié)構(gòu)氧化鈦材料作為主體負載蛋白質(zhì)制造生物傳感器的方法。這些納米結(jié)構(gòu)包括氧化鈦納米顆粒、氧化鈦納米管、介孔氧化鈦、氧化鈦鈉米片等[15－19]。

我們通過對層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀進行剝離，制備得到了Ti0.865O2納米片溶膠，并且用此Ti0.865O2納米片固定血紅蛋白，實現(xiàn)了血紅蛋白有效地直接電子轉(zhuǎn)移，同時考察了血紅蛋白修飾電極（記為Hb/ Ti0.865O2/PG）對H2O2的電催化行為。

1 試驗方法

1.1 試劑

采用分析純氧化鈦，碳酸鋰，碳酸鉀，濃鹽酸，四正丁基氫氧化銨（TBAOH，40 wt %水溶液）。其余試劑和材料還有血紅蛋白（Hb, 分子量68 000，等電點pI為6.8，上海華美生物試劑公司）0.1 mol·L-1，pH值為5.6的磷酸緩沖溶液(PBS用Na2HPO4與NaH2PO4溶液按一定比例配制)，去離子試驗用水，熱解石墨電極，鉑絲導(dǎo)線，銀漿。

1.2 血紅蛋白的固定

將按文獻[20]制備得到層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀（化學(xué)式K0.8Ti1.73Li0.27O4）的粉體質(zhì)子化，得到固體鈦酸（H1.07Ti1.73O4·H2O），其步驟如下：將鈦酸鋰鉀與1.0 M 鹽酸以1 g/100 mL的固液比進行質(zhì)子交換反應(yīng)，并室溫攪拌一天。為了使質(zhì)子化充分，需要重復(fù)上述步驟三次，然后離心、水洗、室溫風(fēng)干。將此固體鈦酸分散在四正丁基氫氧化銨水溶液中，攪拌大約7天，得到懸浮液，然后在8 000 r/min下離心分離，得到上層氧化鈦（Ti0.865O2）納米片溶膠[21]。調(diào)整pH值致8左右；調(diào)整濃度為1 mg/ mL，備用。此納米片溶膠和3.8 mg/mL的血紅蛋白溶液等體積混合，再逐滴加入1.0 M稀醋酸。當體系pH值在5.7左右時，引發(fā)沉淀生成。在pH值為5.7左右時，血紅蛋白帶正電荷，并與帶正電荷的Ti0.865O2納米片通過靜電力組裝在一起。

1.3 電極的制備

將熱解石墨(PG)電極分別用粗砂紙打磨，并用氧化鋁粉拋光，然后分別在丙酮和去離子水中超聲清洗5分鐘，最后用銀漿將電極和鉑絲導(dǎo)線相連。將固定化酶懸浮液滴涂在電極表面，在空氣中干燥，即得實驗用血紅蛋白修飾電極Hb/ Ti0.865O2/PG。電極不用時，在4 ℃空氣中保存。

1.4 測試儀器及方法

在日本理學(xué)Rigaku D/Max-rB型X射線衍射儀上進行X射線衍射測試。小角度X射線衍射測試條件為：掃描速度為0.6o/min；掃描步長為0.002o。

在CHI440電化學(xué)工作站上進行循環(huán)伏安和時間電流測試。 所有的電化學(xué)測試都是在室溫下（22℃±2℃）的三電極電解池中進行。熱解石墨為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極。在檢測雙氧水的過程中，向工作電極加－0.4 V（vs. Ag/AgCl）的電壓，直至得到穩(wěn)態(tài)電流，然后向池中加入一定量的雙氧水，并記錄電流隨時間的變化。在所有的電化學(xué)測試前，都要用高純氮氣向溶液鼓泡30分鐘來除氧。所有的測試也都是在氮氣保護環(huán)境中進行的，以排除氧氣的干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)分析

圖1是試驗中合成的層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀K0.8Ti1.73Li0.27O4和質(zhì)子化的H1.07Ti1.73O4·H2O的粉末X射線衍射圖。所得結(jié)果與以前文獻[20,22]報道的晶胞參數(shù)相同，并已經(jīng)對衍射結(jié)果進行了指標化。

圖1 (a) H1.07Ti1.73O4·H2O, (b) K0.8Ti1.73Li0.27O4的粉末X射線衍射圖Fig. 1 Powder X-ray diffraction patterns for (a) H1.07Ti1.73O4·H2O, (b) K0.8Ti1.73Li0.27O4

圖2 顯示的是固定化酶的小角X射線衍射圖。低角度出現(xiàn)的比較強的衍射峰，說明了血紅蛋白固定在氧化鈦無機層的中間。XRD分析表明，對于此種樣品，層間距為7.0 nm，減去氧化鈦單層厚度0.75 nm，為6.25 nm，略小于蛋白質(zhì)分子(5.3 nm × 5.4 nm× 6.5 nm)最大軸6.5 nm，因此蛋白質(zhì)在層間屬于單層規(guī)則排列。

圖2 Hb/Ti0.865O2修飾電極的衍射圖譜Fig. 2 XRD pattern of Hb/Ti0.865O2modified electrode

2.2 血紅蛋白的直接電化學(xué)

圖3顯示的是在濃度為0.1 M，pH值為5.6的磷酸緩沖溶液中Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極（a）和氧化鈦納米片石墨修飾電極（b）的循環(huán)伏安曲線，掃描速度是100 mV· s-1。Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極有一對形狀相似、大小相當?shù)难趸€原峰，分別在－281 mV和－179 mV，說明存在著可逆的電子轉(zhuǎn)移。在掃描電壓范圍內(nèi)，氧化鈦修飾電極沒有電化學(xué)響應(yīng)，是非電活性的，因而可以判斷這對氧化還原峰是來源于血紅蛋白分子的氧化還原。

圖3在濃度為0.1M， pH為5.6的磷酸緩沖溶液中Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極a和氧化鈦納米片石墨修飾電極b的循環(huán)伏安曲線（掃描速度是100 mV· s-1）Fig. 3 CVs of a titania nanosheets modified electrode, b Hb modified electrode in 0.1M, pH 5.6 PBS at a scan rate of 100 mV· s-1

圖4 顯示的是在不同掃描速率下，Hb/Ti0.865O2修飾電極的循環(huán)伏安曲線。隨著掃描速率的增加，峰電流也不斷增加，而且呈線形關(guān)系，說明這個電極反應(yīng)是一個表面控制的準可逆過程。

2.3 溶液pH值對電極的影響

固定的血紅蛋白的電化學(xué)性質(zhì)和溶液的pH值密切相關(guān)。圖5顯示的是式電位和pH值之間的關(guān)系。當pH值在3.3到11之間時，式電位和pH值呈線性關(guān)系，斜率是－47mV·pH-1。理論預(yù)測含血紅素蛋白在發(fā)生可逆電子轉(zhuǎn)移時伴隨著質(zhì)子的轉(zhuǎn)移過程，式電位對pH值呈線性關(guān)系，在室溫時斜率的理論值為－59mV·pH-1。雖然實驗值比理論值稍小，但是在誤差范圍以內(nèi)。當pH值大于11或者小于3.3時，式電位對pH值明顯偏離原來的直線關(guān)系，說明蛋白質(zhì)發(fā)生了某種變性，導(dǎo)致了前面的一電子一質(zhì)子機制的失效。

圖4 Hb/Ti0.865O2修飾電極在0.1 M， pH值為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線（掃描速度分別為100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900和1000 mV·s-1；插圖表示氧化和還原峰電流對掃描速度的線性關(guān)系）Fig. 4 CVs of Hb modified electrode in 0.1M pH 5.6 PBS at a scan rate of 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 and 1000 mV s-1. Inset: Plot of peak current vs. scan rate

圖5 Hb/Ti0.865O2修飾電極式電位對pH值的線性關(guān)系Fig. 5 The linear plot of the formal potentials obtained from CV at a scan rate of 200 mV· s-1for the Hb modified electrode vs. pH

2.4 血紅蛋白對雙氧水的電催化行為

圖6描述了恒定電位為－400 mV (vs. Ag/AgCl)時，Hb/Ti0.865O2修飾電極對雙氧水濃度變化的時間-電流響應(yīng)曲線，每次加入雙氧水的濃度為50 μM。由圖6可見，催化峰電流隨H2O2濃度的增大而增大，在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系： ipc= 21.65 + 0.01 c (H2O2)，相關(guān)系數(shù)r = 0. 999。由此可知，修飾電極的檢測線性范圍為50 μM到2.2 mM，檢測限為20 μM，對應(yīng)的靈敏度為10 uA·mM-1·cm-2。

圖6 在0.1 M， pH值為5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，－400mV的電壓下Hb/Ti0.865O2修飾電極對雙氧水的電流響應(yīng)曲線（每次加入雙氧水的濃度為50μM）Fig. 6 Amperometric response of Hb/Ti0.865O2modified electrode at -400 mV upon successive addition of 50 μM H2O2to 0.1M, pH 5.6 PBS buffer solution (pH 5.6)

3 結(jié)論

用剝離-重組的方法制備了Hb/Ti0.865O2修飾的熱解石墨電極。Hb在此修飾電極上能進行直接電子傳遞。用循環(huán)伏安法研究了Hb的電化學(xué)行為。該電極對H2O2表現(xiàn)出良好的電催化性能，催化峰電流在一定范圍內(nèi)與H2O2濃度呈線性關(guān)系，可作為生物傳感器檢測H2O2。

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Direct Electrochemistry and Electrocatalysis of Hemoglobin Entrapped in the Galleries of Ti0.865O2Nanosheets

WU Yi-hua
(School of Urban Development and Environmental Engineering, Shanghai Second Polytechnic University, Shanghai, 201209, P.R. China)

Hb/Ti0.865O2nanosheets were prepared by exfoliated from the layered lepidocrocite-related potassium lithium titanate. Hemoglobin (Hb) was entrapp in the galleries of Ti0.865O2nanosheets. The CV (cyclic voltametry) results of the Hb/Ti0.865O2modified pyrolytic graphite electrode showed a pair of well-defined, quasi reversible redox peaks centered at -230 mV (vs. Ag/AgCl) in pH 5.6 phosphate buffer solution. The modified electrode exhibited good electrocatalytic response for monitoring H2O2and have a large linear detection range from 50 μM to 2.2 mM and a sensitivity of 10 μA mM-1cm-2.

hemoglobin; hydrogen peroxide; direct electrochemistry; electrocatalysis

O614.41

A

1001-4543(2010)01-0001-06

2009-09-25;

2009-12-24

吳益華（1981－），男，江蘇無錫人，博士，主要研究方向為復(fù)合材料，電子郵件：yhwu@eed.sspu.cn。

上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金（No.egd08011）