張歡，蔡小波，施曉琴，王震，呂建新

(溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

EGF-IL-18在畢赤酵母中的表達(dá)

張歡，蔡小波，施曉琴，王震，呂建新

(溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

目的：在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)人表皮生長因子受體干擾基序和白細(xì)胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR擴(kuò)增EGF-IL-18基因，克隆到表達(dá)載體pPIC9K，重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后用電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母GS115，篩選重組子，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)EGF-IL-18融合蛋白。結(jié)果：序列分析表明，克隆到pPIC9K載體中的EGF-IL-18基因與設(shè)計(jì)相符，SDS-PAGE電泳分析顯示表達(dá)產(chǎn)物EGFIL-18以可溶性分子存在于酵母培養(yǎng)基中，Western印記表明表達(dá)產(chǎn)物EGF-IL-18具有良好的抗原性。結(jié)論：重組蛋白EGF-IL-18在畢赤酵母GS115中成功分泌表達(dá)。

重組融合蛋白質(zhì)類；EGF-IL-18；克隆，分子；畢赤酵母

白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）又稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子，于1996年由Ushio等克隆，其前體含193個(gè)氨基酸，成熟肽為157個(gè)氨基酸，以單體形式發(fā)揮作用。IL-18能促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖活化[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL-18具有明顯的抗腫瘤作用[3]，但由于IL-18的效應(yīng)細(xì)胞——Th1和NK細(xì)胞廣泛分布于人體各部位，容易激發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生副作用[4]，因此，需要一種導(dǎo)向序列來加強(qiáng)IL-18對腫瘤細(xì)胞的靶向性。

另一方面，人表皮生長因子受體（EGFR）配體的第三個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)保守基序（C-loop）可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的EGFR但并無活化EGFR的功能，被稱為EGF受體干擾基序[5]。這樣融合EGF受體干擾基序和IL-18成熟肽分子，能夠得到一個(gè)具有腫瘤細(xì)胞靶向性和抗腫瘤效應(yīng)的多功能融合蛋白（EGFIL-18）[6-8]。

本研究通過構(gòu)建pPIC9K-EGF-IL-18真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGF-IL-18蛋白的工程菌，為融合蛋白EGF-IL-18的下一步研究和應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒菌株E.coli DH-5α，質(zhì)粒pFUSEGF-IL-18由本實(shí)驗(yàn)室保存。pPIC9K，GS115購自invitrogen。

1.2酶與試劑EcoR I內(nèi)切酶、Not I內(nèi)切酶、Sac I內(nèi)切酶、Ex Taq酶、T4DNA連接酶、Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購自Takara。引物由Takara合成。Tryptone、Yeast extract購自英國OXOID公司。YNB、生物素、G418 購自上海生工。核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自碧云天。鼠抗人IL-18單克抗隆抗體購自MBL公司，ECL發(fā)光試劑盒購自珠海百奧公司。PVDF膜為美國BIO-RAD產(chǎn)品。

1.3 目的基因EGF-IL-18的擴(kuò)增以含有EGF-IL-18基因的重組質(zhì)粒pFUS-EGF-IL-18為模板，用引物primer1：5’-CCGGAATTCATGCGCTGCTCCCATG-3’（下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）和primer2：5’-ATT TGCGGCCGCCTAGTCTTCGTTTTG-3’（下劃線部分Not I酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增EGF-IL-18基因。反應(yīng)體系為25μL：模板1μL、引物各0.5μL、Ex Taq 酶0.2μL、MgCl22μL、dNTP 2μL，ddH2O 18.8μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約600 bp處條帶。EcoR I、Not I雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶連接于同樣酶切的表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH-5α，通過含氨芐青霉素的LB平板篩選，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集細(xì)菌，抽提重組質(zhì)粒pPIC9KEGF-IL-18，進(jìn)行酶切和PCR鑒定并測序(由Takara公司完成)。

1.5 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株按照Invitrogen公司畢赤酵母試劑盒操作指南的方法，將酵母菌GS115制備成感受態(tài)，取出80μL感受態(tài)細(xì)胞與5～10μg Sac I單酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒混合，轉(zhuǎn)入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，冰浴5 min，于1500 V，25μF，200 Ω條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。將電轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基（MD）選擇平板上，置于30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察轉(zhuǎn)化子的生長。

1.6 多拷貝EGF-IL-18基因整合轉(zhuǎn)化子的篩選將MD培養(yǎng)基平皿中長出的最初His+轉(zhuǎn)化子，用影印法依次接種到含G418濃度梯度為0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL的YPD平板上，逐級篩選高G418抗性菌株。

1.7 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測取篩選得到的高G418抗性單菌落中少量菌于沸水中煮5 min后作為模板，用引物5AOX1（5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’）和3AOX1（5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’）PCR擴(kuò)增鑒定整合到酵母染色體上的目的基因，PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.8 EGF-IL-18在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)挑取抗高濃度G418抗性的pPIC9K-EGF-IL-18的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，接種到BMGY培養(yǎng)液中30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=6，離心收集酵母細(xì)胞，用BMMY培養(yǎng)液重懸培養(yǎng)，每隔24 h加甲醇至終濃度為1%，72 h后離心取培養(yǎng)基上清。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測將培養(yǎng)基上清超濾濃縮后，用12% SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。加一抗鼠抗人IL-18單克隆抗體4 ℃過夜，用TBST充分清洗3次后，加二抗HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG孵育2 h，然后用ECL法進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 EGF-IL-18基因擴(kuò)增以pFUS-EGF-IL-18質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳后可見一條清晰的特異性擴(kuò)增帶，擴(kuò)增片段位于600 bp處左右與預(yù)計(jì)580 bp相符（見圖1）。

圖1EGF-IL-18基因PCR擴(kuò)增圖

圖2重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定圖

2.2重組質(zhì)粒pPIC9K-EGF-IL-18的鑒定重組質(zhì)粒pPIC9K-EGF-IL-18的EcoR I、Not I雙酶切產(chǎn)物以及PCR鑒定產(chǎn)物在約600 bp處出現(xiàn)條帶與預(yù)期EGFIL-18（580 bp）基因片段大小一致（見圖2）。對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果所克隆的基因序列與已知序列(Genebank：AF454397)的同源性為100%。

2.3 畢赤酵母高拷貝表達(dá)菌的篩選和轉(zhuǎn)化子的鑒定重組質(zhì)粒pPIC9K-EGF-IL-18經(jīng)Sac I酶酶切線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得抗1 mg/mL G418的酵母轉(zhuǎn)化子3個(gè)。PCR鑒定證實(shí)3個(gè)轉(zhuǎn)化子都整合含有目的基因，3個(gè)重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18都可擴(kuò)出約1072 bp大小的片段，而重組酵母菌株GS115/pPIC9K只擴(kuò)出約492 bp的條帶（如圖3所示）。

圖3畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定圖

圖4EGF-IL-18蛋白的SDS-PAGE和Western blot鑒定圖

2.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和Western blot鑒定重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，離心收集培養(yǎng)基上清，超濾濃縮后，分別經(jīng)12% SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果表明甲醇誘導(dǎo)24、48、72 h的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18的表達(dá)產(chǎn)物在相對分子質(zhì)量約21 kD處有一明顯的染色條帶，而重組酵母菌株GS115/pPIC9K的表達(dá)產(chǎn)物無該條帶（見圖4a）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示，該21 kD處的蛋白條帶可與鼠抗人IL-18單克隆抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)（見圖4b），證實(shí)EGFIL-18蛋白在重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18中成功分泌表達(dá)。

3 討論

本課題組首次合成EGF-IL-18融合基因，并已成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)和原核系統(tǒng)中表達(dá)EGF-IL-18融合蛋白[7-8]。與本次實(shí)驗(yàn)中利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)相比而言，昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)同樣也是真核表達(dá)系統(tǒng)，但其EGF-IL-18蛋白產(chǎn)業(yè)化成本高于酵母表達(dá)系統(tǒng)。而利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EGF-IL-18融合蛋白時(shí)，目的蛋白產(chǎn)量最高，但是需經(jīng)過較復(fù)雜的復(fù)性過程，且目的蛋白比活性低于真核表達(dá)的目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)媒湍副磉_(dá)系統(tǒng)，希望在保持較高的目的蛋白比活的同時(shí)，提高真核系統(tǒng)的表達(dá)量，獲得較高產(chǎn)量、高比活的EGF-IL-18蛋白。

另外，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EGF-IL-18融合蛋白時(shí)，分泌性的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K具有釀酒酵母信號(hào)肽α因子，當(dāng)培養(yǎng)體系以甲醇為唯一碳源時(shí)，可強(qiáng)烈介導(dǎo)天然EGF-IL-18蛋白分泌到胞外，而信號(hào)肽α因子自身被信號(hào)肽酶識(shí)別切割，加之酵母自身分泌蛋白比較少，這樣就非常適合天然EGF-IL-18融合蛋白的分離，有效地降低了純化成本。

目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)[9]。某些細(xì)胞因子采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，蛋白分子量會(huì)大于實(shí)際分子量，比如IL-10經(jīng)畢赤酵母分泌表達(dá)后其分子量為20.2 kD大于實(shí)際的18.5 kD[10]。而GS115/pPIC9K-EGF-IL-18的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在約21 kD處有特異性條帶，與實(shí)際分子量21 kD相符。這是由于EGFIL-18蛋白不像IL-10等細(xì)胞因子那樣含有糖基化位點(diǎn)，因而通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后不會(huì)出現(xiàn)蛋白糖基化而導(dǎo)致蛋白分子量增大現(xiàn)象。

分析SDS-PAGE結(jié)果，發(fā)現(xiàn)重組酵母菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)24 h即可觀察到目的蛋白條帶，而經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72 h目的蛋白條帶未見明顯加深。這可能是由于隨著培養(yǎng)體系中酵母菌濃度的增加，其他一些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白水解酶分泌表達(dá)也相應(yīng)增多，從而導(dǎo)致重組蛋白逐漸被降解，最終蛋白表達(dá)量無法隨時(shí)間增加而提高。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，有效地表達(dá)了EGF-IL-18融合蛋白，為EGF-IL-18蛋白進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

Expression of EGF-IL-18 in pichia pastoris

ZHANG Huan，CAI Xiaobo，SHI Xiaoqin，WANG Zhen，LV Jianxin.Zhejiang Provinicial Key Lab of Medical Genetics，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To express human epidermal growth factor receptor interferential motif and interleukin-18（EGF-IL-18）fusion protein in the methylotrophic pichia pastoris expression system. Methods:EGF-IL-18 gene was amplified by PCR， and then cloned into the expression vector of pPIC9K. The pPIC9K-EGF-IL-18 was linearized and electrotransformed into Pichia pastoris GS115. The recombinants were screened and then induced by methanol in shake flask cultures. Results: DNA sequencing analysis showed that the sequence of cloned EGF-IL-18 was accorded with that of designment. The recombinant EGF-IL-18 protein was detected in the culture medium by SDS-PAGE. Western blot results indicated that the recombinant EGF-IL-18 protein exhibited high antigenicity. Conclusion:The recombinant protein of EGF-IL-18 is successfully secretory expressed in Pichia pastoris GS115.

recombinant；fusion protein；EGF-IL-18；cloning molecular；pichia pastoris

book=7,ebook=14

Q78[

]A

]1000-2138 (2010)04-0322-05

2010-03-02

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)和優(yōu)先主題計(jì)劃資助項(xiàng)目（2009C13038）；浙江省教育廳2008年度大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃立項(xiàng)資助項(xiàng)目。

張歡（1984-），男，浙江溫州人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jxlu313@163. com。

tected in the culture medium by SDS-PAGE. Western blot results indicated that the recombinant EGF-IL-18 protein exhibited high antigenicity. Conclusion:The recombinant protein of EGF-IL-18 is successfully secretory expressed in Pichia pastoris GS115.

recombinant；fusion protein；EGF-IL-18；cloning molecular；pichia pastoris

book=7,ebook=14

Q78

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]1000-2138 (2010)04-0322-05

2010-03-02

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)和優(yōu)先主題計(jì)劃資助項(xiàng)目（2009C13038）；浙江省教育廳2008年度大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃立項(xiàng)資助項(xiàng)目。

張歡（1984-），男，浙江溫州人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jxlu313@163. com。