劉麗，李湘凌，范麗，王成慧，楊善謀，袁峰，周濤發(fā)

合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥230009

在土壤污染方面，為了防止土壤質量退化，實現(xiàn)土壤資源的持續(xù)利用，對土壤質量的評估和預測顯得越來越重要。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的基本組分，土壤微生物對土壤中的動植物殘體和土壤有機質及其有害物質的分解、生物化學循環(huán)和土壤結構的形成過程起著重要的調節(jié)作用[1-2]。污染元素在土壤中不斷累積必然會破壞土壤固有微生物群落結構及其活性，減弱土壤微生物的作用，最終使得土壤肥力和質量降低[3]。因此，土壤微生物群落結構特征和微生物活性狀況可反映出污染元素的污染程度[4]。

污染元素作為最嚴重的土壤污染物之一，可對土壤微生物產生較大的影響，而土壤微生物能夠在種群、生理生化、遺傳等對重金屬脅迫做出響應以適應元素污染環(huán)境[5]。近年來，由于重金屬等污染元素污染毒害作用越來越威脅著人類的生存環(huán)境和身體健康，對其研究日益增多，尤其是在生物修復方面已經成為研究重點[6]。采用傳統(tǒng)的淋濾法、客土法等物理化學方法修復重金屬污染土壤是非常困難和昂貴的，生物修復法能克服傳統(tǒng)方法中的缺點，越來越受到重視。研究土壤微生物對元素污染響應的方式及其機理，對元素污染土壤的生物評價和生物修復等方面具有指導意義[7]。污染元素隨著污水進人土壤后，一方面，它的遷移轉化受到土壤理化性質的溶解和固定作用，另一方面又受到微生物的溶解、吸收和富集作用，同時對微生物的生長、代謝產生影響[8-10]。本文通過銅陵礦集區(qū)土壤中重金屬及非金屬污染元素含量與土壤中微生物生物量之間的對應關系，研究其環(huán)境效應，土壤中的微生物種類繁多，有的可作為環(huán)境載體吸持重金屬等污染物，可從中提取一些耐重金屬的微生物，為土壤生物修復提供優(yōu)勢菌種，以期達到土壤重金屬污染修復的目的。

1 研究區(qū)概況

銅陵礦集區(qū)位于長江中下游鐵銅金多金屬成礦帶的中部。礦集區(qū)的礦業(yè)活動已引起了諸多的環(huán)境負效應，包括冶煉渣堆、廢石堆、尾礦砂和巖礦體等的自然風化，酸性礦山排水的產生和重金屬的釋放，礦區(qū)水系及其沉積物潛在生態(tài)危害、土壤污染以及生物損害、大氣變化等。已有研究顯示，銅陵礦集區(qū)表層土壤中的Zn、Cu、Cd、Pb等重金屬元素含量大部分超標[11-13]。

2 材料和方法

2.1 樣品采集

土壤樣品的采集采用網格采樣法，約每隔4 km取一樣品，如圖 1所示，在銅陵礦集區(qū)共采集 48個樣品。用鐵鏟采集深度為20 cm的土樣約20 g裝入無菌牛皮袋中，封好袋口，另取一部分土壤約100 g于采樣袋中，并記錄取樣地點及環(huán)境特征和詳細日期。取回土樣后，將一部分新鮮土壤置于0 ℃～4 ℃保存供測試土壤微生物用；另一部分土壤風干后用來測定土壤基本理化性質和元素含量。

圖1 銅陵地區(qū)采樣分布圖Fig.1 Sampling distribution of Tongling area

2.2 土壤中微生物的分離與計數(shù)

2.2.1 微生物培養(yǎng)基的制備

分別配制三種不同的培養(yǎng)基，以用于分離土壤中的細菌、放線菌、高鐵還原菌。三種培養(yǎng)基的配制為[14]：①細菌：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，pH7.0；②放線菌（高氏一號培養(yǎng)基）：可溶性淀粉 20 g、氯化鈉0.5 g、硝酸鉀1 g、磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，pH7.4~7.6；③高鐵還原菌：蔗糖5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸銨1.0 g、碳酸鈣5 g、氫氧化鐵0.5 g、酵母粉0.15 g、蒸餾水1000 mL。這些培養(yǎng)基均在0.1 Mpa下滅菌20 min。

2.2.2 微生物的分離與計數(shù)

細菌和放線菌采用稀釋平板涂布法計數(shù)，高鐵還原菌采用最大或然數(shù)法計數(shù)。首先進行土壤懸液的制備，準確稱取10 g土壤，放入裝有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，振蕩10 min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，再依次用無菌試管稀釋溶液至所需要的梯度。細菌稀釋濃度一般是10-4~10-6，放線菌為 10-3~10-5，用無菌移液管吸取0.1 mL接種到含有20 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿正中間，用涂布棒涂布均勻。每個濃度梯度分別做三個重復。接種后的培養(yǎng)皿倒置于 28 ℃~30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)1 d，放線菌培養(yǎng)5~7 d。然后取出，選取細菌和放線菌出現(xiàn)菌落數(shù)在 30~300之間的培養(yǎng)皿進行計數(shù)，然后折算出每1 g干土中的菌數(shù)。

高鐵還原菌是用稀釋梯度為10-1~10-6的土壤懸浮液接種，每管裝培養(yǎng)液20 mL，接種1 mL，每個稀釋梯度重復四次。28 ℃~30℃深層培養(yǎng)7~10 d，用1%2，a-聯(lián)吡啶的10%醋酸溶液（按體積比配制）測定，如有亞鐵存在，則成紅色反應。由反應情況得出數(shù)量指標，再對照最大或然數(shù)表得出最終結果。

2.3 土樣中元素含量的測定

采集的土壤樣品在室內風干約50 g，過20目篩并充分混勻后，送國土資源部合肥礦產資源監(jiān)督檢測中心測試。As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量采用日本理學ZSX100e型X射線熒光光譜儀測得。

3 結果與討論

銅陵礦集區(qū)土壤中As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量與土壤中細菌、放線菌、高鐵還原菌數(shù)量之間的對應關系如圖2~7所示?？梢?，土壤污染元素在低濃度條件下對土壤中微生物的數(shù)量有一定刺激增長作用，但高濃度則會對微生物的數(shù)量起抑制作用；同時，由于部分微生物受污染元素的脅迫而產生了耐受性，因此在一些污染元素含量高的區(qū)域微生物含量也高。具體的相關關系為，As、Au、Zn、Cu與細菌和放線菌，Cd、Pb與放線菌的含量呈負相關關系，指示了土壤中高濃度污染元素對微生物的抑制作用；Cd、Pb與細菌，Cd、Zn與高鐵還原菌的含量呈正相關關系，反映部分微生物受污染元素的脅迫已產生了耐受性；Au、Pb、As與高鐵還原菌數(shù)量的關系不明顯。不同類群的微生物對污染元素的敏感程度不同，在本實驗中，三種菌種的敏感程度依次是：放線菌>細菌>高鐵還原菌。

微生物在自然界物質的分解、轉化和循環(huán)中起重要作用，在其生長代謝和分化過程中，除了 K、Na、Ca、Mg外，還需要有一些具有特殊生物學功能的微量金屬元素[15]，如Cu是多酚氧化酶的組分并為羧化酶作用所必需。但是當環(huán)境中的元素尤其是重金屬元素濃度增高到一定程度時，就會影響甚至抑制微生物的生長及代謝活動[16]。Cd對細胞具有致突變效應，導致DNA鏈斷裂，Cd還可與含羧基、氨基，特別是含琉基的蛋白質分子結合，而使許多酶的活性受到抑制和破壞，使腎、肝等組織中的酶系功能受到損害[17]。Pb可與微生物體內一系列蛋白質、酶和氨基酸內的功能團相結合，從多方面干擾機體的生化和生理功能，可造成細胞膜的損傷，破壞營養(yǎng)物質的運輸。同時，在高濃度下，重金屬離子可在胞內形成非專一性的復雜化合物而產生毒性作用[18]。本文的土樣來自于銅陵礦集區(qū)，其重金屬等污染元素含量已明顯高于土壤背景值，土壤元素污染較嚴重，因此，生長在其中的微生物已受到污染元素脅迫的影響，如As、Au、Zn、Cu對細菌以及As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb對放線菌的脅迫，均導致了微生物數(shù)量的降低，通過實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，微生物在重金屬含量高的區(qū)域和含量低的區(qū)域的數(shù)量下降了大約2~3個數(shù)量級，有些區(qū)域微生物數(shù)量下降了約50%，重金屬對微生物的影響顯著。

圖2 As與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.2 The correspondence of As and the number of microorganisms in the soil

圖3 Au與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.3 The correspondence of Au and the number of microorganisms in the soil

圖4 Cd與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.4 The correspondence of Cd and the number of microorganisms in the soil

圖5 Zn與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.5 The correspondence of Zn and the number of microorganisms in the soil

低濃度的重金屬等元素刺激微生物的生長，而高濃度則抑制微生物的生長，一般是基于重金屬與微生物之間的相互作用。段學軍[19]在重金屬影響微生物數(shù)量及群落結構多樣性方面進行了研究，通過模擬試驗，得到了重金屬元素對微生物的毒性效應與其濃度的關系，二者一般呈負相關關系，其相關顯著性與重金屬種類、土壤類型及微生物類群有關。Garland[20]、Tucker et al[21]研究發(fā)現(xiàn)，土壤中重金屬含量超過一定濃度時，對微生物有著明顯的毒害作用，能引起蛋白質變性及改變生物膜透性，土壤微生物的生長、繁殖和代謝均受到干擾，這不僅使得微生物生物量下降，碳氮比亦發(fā)生變化，還影響到有機質的微生物轉化效率[22]，導致微生物群落結構發(fā)生變化，種群減少、生態(tài)平衡穩(wěn)定性受到破壞。Brookes et al[23]采用土壤熏蒸法測定了使用含重金屬的污泥達 20年的農業(yè)土壤中微生物的總量，認為重金屬對土壤微生物總量有抑制作用，低濃度的重金屬元素對微生物生物量沒有大的影響，而高濃度的 Cu、Zn使生物量下降 40%。楊元根等[22]研究對比了農村土壤和城市土壤中重金屬含量對微生物特征的影響，發(fā)現(xiàn)含高濃度重金屬的城市土壤中，微生物的生物量顯著降低。在銅陵礦集區(qū)，隨著土壤中污染元素如As、Au、Zn、Cu濃度的升高，細菌的數(shù)量隨之下降，而As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb的濃度升高會導致放線菌數(shù)量的下降。因此，微生物的生物量是對土壤中重金屬等元素污染的敏感指標之一，當然，已有研究還提出了微生物活性、微生物商和代謝商變化等指標[24]，對于銅陵礦集區(qū)而言，建立相關微生物土壤質量評價指標的研究還有待進一步的開展。

圖6 Cu與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.6 The correspondence of Cu and the number of microorganisms in the soil

圖7 Pb與土壤中微生物數(shù)量的對應關系Fig.7 The correspondence of Pb and the number of microorganisms in the soil

同時也存在另一種情況，由于微生物對重金屬等污染元素存在一定的耐受性或由于受脅迫而產生了耐受性，微生物數(shù)量和污染元素含量之間也會存在一定的正相關性。在銅陵礦集區(qū)，Cd含量與細菌、高鐵還原菌數(shù)量（圖 4），Zn含量與高鐵還原菌數(shù)量（圖5），Pb含量與細菌數(shù)量（圖7），均表現(xiàn)出了一定的正相關關系。由實驗所得數(shù)據(jù)可以看出在重金屬含量高的區(qū)域，微生物的數(shù)量并沒有減少，相反其數(shù)量隨著重金屬含量的增高而增多, 在Cd、Zn、Pb含量高的區(qū)域微生物含量較重金屬含量低的高約一個數(shù)量級。Cd、Zn、Pb是世界公認的有害重金屬物質[25]，本文研究顯示，銅陵礦集區(qū)部分土壤中細菌、高鐵還原菌對這三種重金屬元素的抗性水平較高，這可能是由于礦集區(qū)土壤長期受這些重金屬污染，而使其中部分抗性高的微生物菌種取代了敏感菌種，或使部分菌種發(fā)生了基因改變、生理適應，并得到繁殖，這些土壤中所含有的大量的耐性菌種，同時也具有作為土壤重金屬元素污染修復微生物菌種的潛力[26]，微生物對重金屬的抗性和解毒機制，是基于其與重金屬之間的一些相互作用，已有研究表明，微生物對重金屬的作用主要表現(xiàn)在微生物對重金屬的生物積累和生物吸著，包括胞外絡合、沉淀及積累；微生物對重金屬還有一定的生物轉化作用，包括微生物對重金屬的生物氧化還原、甲基化與去甲基化以及重金屬的溶解和有機絡合配位降解轉化重金屬[27]。微生物與重金屬間的作用在工業(yè)上已有一些應用，Sharma[28]等于2000年發(fā)現(xiàn)，在厭氧環(huán)境中加入硫代亞磺酸酯，克氏桿菌可以將Cd2+轉化為CdS沉淀，這一過程在鎘污染廢水的處理中具有重要的意義。

4 結論

（1）銅陵礦集區(qū)土壤中As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量與土壤中細菌、放線菌、高鐵還原菌數(shù)量之間的相關關系為：As、Au、Zn、Cu與細菌和放線菌，Cd、Pb與放線菌的含量呈負相關關系，指示了土壤中高濃度污染元素對微生物的抑制作用；Cd、Pb與細菌，Cd、Zn與高鐵還原菌的含量呈正相關關系，反映部分微生物受污染元素的脅迫已產生了耐受性；Au、Pb、As與高鐵還原菌數(shù)量的關系不明顯。

（2）銅陵礦集區(qū)土壤中三種菌種對污染元素的敏感程度不同，其敏感程度依次是：放線菌>細菌>高鐵還原菌。

（3）銅陵礦集區(qū)部分土壤中，細菌、高鐵還原菌由于其本身的耐受性或由于受脅迫而產生了耐受性，對Cd、Zn、Pb等三種重金屬污染元素的抗性水平較高，具有作為土壤重金屬元素污染修復微生物菌種的潛力。

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