王騰浩, 秦玉梅, 張根華, 鄧少平＊

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

味蕾細(xì)胞的Percoll梯度離心純化技術(shù)研究

王騰浩1, 秦玉梅1, 張根華2, 鄧少平＊1

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310035;2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

以ICR小鼠的菌狀味蕾細(xì)胞為研究對象,利用Percoll梯度離心技術(shù)純化小鼠菌狀味蕾細(xì)胞,通過臺(tái)盼藍(lán)染色和免疫組織化染色方法分別比較純化前后的味蕾細(xì)胞存活率與純度的變化,應(yīng)用透射電鏡從超微結(jié)構(gòu)鑒定味蕾細(xì)胞。結(jié)果顯示:通過不連續(xù)的Percoll密度梯度離心法對味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化,細(xì)胞分層效果明顯,主要位于體積分?jǐn)?shù)20%與40%的Percoll工作液之間;免疫組化結(jié)果表明:純化后味蕾細(xì)胞的純度顯著提高,從10%提高到65%(P<0.01),臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示:純化后細(xì)胞活度達(dá)94%,電鏡則從超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)了純化的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞。

味蕾細(xì)胞;純化技術(shù);Percoll;超微結(jié)構(gòu)

味蕾是哺乳動(dòng)物味覺的主要感覺器,主要分布在舌、上軟腭、咽、喉和食道上部[1]。舌上皮中有4種不同空間分布的舌乳頭(lingual papille):絲狀乳頭(filiform papillae,FI)、菌狀乳頭(fungiform papillae,FF)、葉狀乳頭(foliate papillae,FL)和輪廓狀乳頭(circumvallate papillae,CV),其中FF、CV、FL乳頭因含味蕾而被稱為味乳頭(gustatory papillae)[2]。FF乳頭主要位于舌前部三分之二的區(qū)域,哺乳動(dòng)物的每個(gè)FF乳頭含一到多個(gè)味蕾[3]。每個(gè)味蕾有50～150個(gè)細(xì)胞組成,這些細(xì)胞根據(jù)其超微結(jié)構(gòu)特征將這些細(xì)胞分為4種類型[4]:Ⅰ型細(xì)胞(暗細(xì)胞)、Ⅱ型細(xì)胞(亮細(xì)胞)、Ⅲ型細(xì)胞(中間細(xì)胞)和Ⅳ型細(xì)胞(基細(xì)胞)。其中Ⅱ型和Ⅲ型細(xì)胞被認(rèn)為是味覺感受細(xì)胞,已成為味覺生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著味蕾細(xì)胞分離方法的建立和發(fā)展,味蕾細(xì)胞的研究已經(jīng)取得長足的進(jìn)展。如何獲取大量高純度、高活性的味蕾細(xì)胞仍是亟待解決的問題。

味蕾細(xì)胞是特化的上皮細(xì)胞,對微環(huán)境的要求比較嚴(yán)格,且細(xì)胞在形成之后平均每十天更新一次,而培養(yǎng)的味蕾細(xì)胞不具備增殖功能[7],故很難通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法來獲取大量味蕾細(xì)胞?，F(xiàn)在味蕾細(xì)胞的分離技術(shù)相對較少,主要有直接分離法、微吸管吸取法和兩步酶解法[5,6],所分離的細(xì)胞在數(shù)量和純度上均尚難以滿足對味蕾細(xì)胞離體研究的需要。作者通過酶-機(jī)械法獲取細(xì)胞懸液,使用不連續(xù)的Percoll密度梯度離心法分離純化味蕾細(xì)胞,通過優(yōu)化條件建立了一套有效的味蕾細(xì)胞分離純化技術(shù),為離體味蕾細(xì)胞生理生化特性及味蕾細(xì)胞傳感器研究提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周ICR小鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素與鏈霉素均購自Gibco公司;MCDB 153、膠原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)、中性蛋白酶Ⅱ(dispaseⅡ)、胰島素(insulin)均購自Sigma公司;HEPES購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司、細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin,CK8)購自Epitomics公司,即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,其他試劑均為分析純。1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配制 參考Ozdener等[8]的培養(yǎng)基配置方法,IMDM培養(yǎng)基中添加10% FBS,1:5 MCDB 153,50 ng/mL胰島素和100 U/ mL青霉素與100μg/mL鏈霉素。

Tyrode溶液:NaCl 7.65 g,KCl 0.37 g,CaCl20.89 g,MgCl20.20 g,HEPES 2.38 g,葡萄糖1.80 g,丙酮酸鈉1.10 g,NaHCO30.42 g,p H 7.4。無鈣Tyrode溶液,省略CaCl2。

1.2 方法

1.2.1 味蕾細(xì)胞懸液的制備 取6～8周ICR小鼠CO2致死,斷頭后取舌,舌剪至CV狀乳頭邊緣處。Tyrode溶液清洗舌頭表面的血跡,清洗完畢放入無鈣Tyrode溶液中。用5 ml一次性注射器將0.1～0.3 mL的混合酶液(1∶1混合的1 mg/ml膠原酶Ⅱ+3 mg/ml中性蛋白酶Ⅱ)注入舌上皮與其下的肌肉層之間,注射器針頭要一直伸至舌尖邊緣后緩慢地注射酶液至舌腫脹,舌背面和側(cè)面少量多次注射酶液。無鈣Tyrode溶液中孵育4～6 min,用眼科鑷將上皮與肌肉層輕輕剝離。將剝離的上皮迅速放入新的Tyrode溶液中,用眼科剪將含有FF乳頭的舌前部1/3區(qū)域剪下,置于冰浴中的Tyrode溶液中備用。將含有FF乳頭的上皮切成大約1 mm2的小碎片,放入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶和0.05%EDTA消化液的培養(yǎng)皿內(nèi),37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化5～10 min,得細(xì)胞懸液。

1.2.2 Percoll離心液梯度分離

1)Percoll工作液的制備 將Percoll母液和Percoll稀釋液按表1所列方案配制Percoll各密度梯度溶液。用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí),可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。

2)裝樣 樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異,一般加樣體積不宜過大,細(xì)胞濃度也不可過高,否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。

3)Percoll離心液梯度的選擇 參考Seta等[9]的方法(1997)并對Percoll工作液進(jìn)行改進(jìn),簡要過程為:先通過在50 mL離心管中加入各種濃度的Percoll工作液各3 mL,濃度從高到低鋪于管中,后加入4 mL 1×107～1×108個(gè)/mL細(xì)胞懸液,觀察細(xì)胞主要集中區(qū)域,選取細(xì)胞分離純化的Percoll梯度濃度。通過實(shí)驗(yàn)選取得出用于純化味蕾細(xì)胞的Percoll工作液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%、40%和20%。用選取的濃度梯度采用兩次離心法對味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化。如圖1為3層不同密度的Pecoll液疊加時(shí)的實(shí)物圖。從下到上分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、40%和20%的Percoll溶液。

表1 Percoll工作液配制表Tab.1 Preparation of Percoll solution of different concentration

圖1 不同密度Percoll溶液疊加圖Fig.1 Discontinuous gradients of three Percoll working solution with the concentration of 70%,40% and 20%from top to bottom

4)味蕾細(xì)胞的純化 將細(xì)胞懸液鋪于上述不連續(xù)密度梯度的Pecoll分離液中,在離心管中先靜置30 min,然后25℃下1 200 r/min離心6 min。分離的細(xì)胞絕大部分位于在兩層Percoll工作液的交界面時(shí),逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞。收集含有Percoll液的細(xì)胞用培養(yǎng)培養(yǎng)液洗滌兩次,計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度后備用。

1.2.3 ABC免疫組化評估味蕾細(xì)胞的純度 制作細(xì)胞爬片,體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛4℃固定60～90 min。室溫1份體積分?jǐn)?shù)30%H2O2與50份純甲醇的混合液中浸泡30 min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水1～2次。后按博士德試劑盒說明操作。DAB顯色封片后普通光學(xué)顯微鏡下觀察。所使用一抗為兔抗CK8的單克隆抗體,稀釋度1∶500。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照,一抗用PBS代替。

1.2.4 味蕾細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)鑒定 純化的細(xì)胞懸液1 000 r/min離心4 min,去上清,將細(xì)胞懸浮于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜。倒掉固定液,用0.1 mol/L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h。倒掉固定液,用0.1 mol/ L,p H 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min。用梯度體積分?jǐn)?shù)(50%,70%,80%,90%和95%)的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理各15 min,再用100%的乙醇處理一次20 min,最后過度到純丙酮處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=1∶1處理樣品1 h,然后用包埋劑與丙酮的混合液V(包埋劑)∶V(丙酮)=3∶1處理樣品3 h,純包埋劑處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來,70℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片,獲得70～90 nm的切片,該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇飽和溶液各染色15 min,用日本J EOL公司的J EM-1230型透射電鏡觀察。

1.2.5 味蕾細(xì)胞活力測定 用臺(tái)盼藍(lán)染色法測定味蕾細(xì)胞的活力。將純化前、后的味蕾細(xì)胞懸液的密度各調(diào)至1×106/mL,取9滴細(xì)胞懸液滴入試管,加入1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色,混勻,滴在計(jì)數(shù)板上。此時(shí)由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞被染成紫藍(lán)色,而活細(xì)胞不被染色。3 min內(nèi)在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)版分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量,按下式計(jì)算味蕾細(xì)胞的存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同梯度層味蕾細(xì)胞形態(tài)和活力

實(shí)驗(yàn)采用離心前將細(xì)胞懸液在離心管中先靜置30 min,使細(xì)胞懸液中的味蕾細(xì)胞下沉,以提高分離效果。25℃、1 200 r/min離心6 min,離心后細(xì)胞主要集中在各濃度液面交界處,各層內(nèi)部細(xì)胞分布較少。各個(gè)細(xì)胞聚集層的細(xì)胞形態(tài)有明顯差異,如圖2所示,原細(xì)胞懸液中混有大量雜細(xì)胞和上皮碎片(圖2(A),且活性相對較低,計(jì)數(shù)1 895個(gè)細(xì)胞,其中413個(gè)臺(tái)盼然染色陽性,成活率為78.21%,經(jīng)純化后體積分?jǐn)?shù)20%Percoll溶液與40%Percoll溶液的液面交界處的分離物以梭形細(xì)胞為主,混有少量圓形細(xì)胞和扁平細(xì)胞(圖2(C)),從形態(tài)上判斷味蕾細(xì)胞主要集中在這一層,將位于此層的細(xì)胞清洗重懸再純化,混雜細(xì)胞的數(shù)量會(huì)進(jìn)一步減少。20%與原液層之間主要為一些內(nèi)徑在5～10μm且大小均勻的圓形細(xì)胞(圖2(B)),最下層的交界面則較多地聚集了一些內(nèi)徑為20～30μm的細(xì)胞(圖2(D)),離心管底部有大塊的上皮碎片。參照表1數(shù)據(jù)可知小鼠味蕾細(xì)胞的密度主要集中在1.03-1.06 g/mL之間,比Seta[10]得出的大鼠的密度要小,并且介于外周非味覺上皮細(xì)胞的密度之間。純化后細(xì)胞活性有較大提高(計(jì)數(shù)了2 478個(gè)細(xì)胞,其中131個(gè)臺(tái)盼藍(lán)著色陽性,成活率為94.71%),主要原因可能是因?yàn)榧兓昂写罅糠俏队X上皮細(xì)胞,這些細(xì)胞在分離過程過受損所致。上述結(jié)果證明了Percoll梯度離心純化味蕾細(xì)胞有利于提高味蕾細(xì)胞的活性。

圖2 Percoll離心后各細(xì)胞聚集層細(xì)胞形態(tài):(A)細(xì)胞原液,(B)20%與原液交界面,(C)20%～40%交界面,(D)40%～70%交界面Fig.2 Cell morphology of different layers after Percoll centrifugation:original cell samples(A),interface between 20%Percoll and cell samples(B), interface between 20%and 40%Percoll(C), interface between 40%and 70%Percoll(D)

2.2 ABC免疫組化定量判定味蕾純化前后細(xì)胞濃度

味蕾細(xì)胞起源于上皮細(xì)胞,是一種簡單的柱狀上皮細(xì)胞,被周圍的復(fù)麟質(zhì)狀上皮細(xì)胞所包圍。有5種CK分子(CK 7、8、18、19和20)在正常的味蕾細(xì)胞中表達(dá),但在其周圍的非味覺細(xì)胞中不表達(dá)。其中CK 8在大量味蕾細(xì)胞表達(dá),是一種良好的成熟和正在成熟的味蕾細(xì)胞的分子標(biāo)記[11]。與其他成熟的味蕾細(xì)胞的標(biāo)記(α-gustducin,PLCβ2, NCAM等)相比,CK 8能夠更充分的表明混雜細(xì)胞中味蕾細(xì)胞的純度。如圖3(A),省略一抗時(shí)味蕾細(xì)胞沒有陽性反應(yīng),以證明此抗體的特異性。從圖3(B)和圖3(C)中可以看出純化后陽性味蕾細(xì)胞的數(shù)量顯著多于純化前,通過計(jì)數(shù)得知純化前陽性味蕾細(xì)胞數(shù)少于10%(8.59±1.29,n=10),而純化后陽性味蕾細(xì)胞數(shù)量顯著提高(P<0.01),大約占細(xì)胞總數(shù)65%(65.7±2.11,n=12)。造成純化后味蕾純度不太理想的原因可能因?yàn)槲独偌?xì)胞分為4種類型,迄今還沒有那種標(biāo)記物能夠完全標(biāo)記所有類型味蕾細(xì)胞。

圖3 純化前后味蕾細(xì)胞的CK8免疫組化。(A)陰性對照,(B)和(C)分別為純化前后味蕾細(xì)胞的CK8免疫組化Fig.3 Immunohistochemistry of CK8 for TBCs before(B)and after(C)purification;the negative contrast is showed in(A)

2.3 味蕾細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)鑒定

圖4 分離味蕾細(xì)胞的透射電鏡圖片,(A)橫切面圖, (B)縱切面圖Fig.4 Transverse section(A)and longitudinal section (B)of an iolated taste bud cell by transmission electron microscopy

味蕾細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也是識(shí)別味蕾細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志,每種類型細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),純化后細(xì)胞的透射電鏡結(jié)果如圖4所示,圖4 (A)圖為細(xì)胞的橫切面,胞漿中含有豐富的微絲和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞核形狀不規(guī)則,含有大量的異染色質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中存在許多100～400 nm的致密團(tuán)粒結(jié)構(gòu)(如箭頭所示),這是I型細(xì)胞的顯著結(jié)構(gòu)特征,I型細(xì)胞是暗細(xì)胞,呈紡錘形,味蕾中其數(shù)量最多。圖4(B)為細(xì)胞的縱切面,細(xì)胞呈梭形,胞漿透亮,具有圓形細(xì)胞核,細(xì)胞頂部細(xì)胞質(zhì)不含有致密顆粒,這是II型細(xì)胞的特點(diǎn)。細(xì)胞純化技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基本技術(shù)之一,它主要是根據(jù)細(xì)胞本身的某些性質(zhì)來分離具有同一性狀的細(xì)胞群。細(xì)胞的分離方法有很多種,常用的細(xì)胞分離純化方法有:速度沉降分離法;等密度沉降分離法;流式細(xì)胞分離儀分離法;免疫磁珠分離法等[12]。與需要抗體的流式細(xì)胞分離儀分離法和免疫磁珠分離法相比,Percoll密度梯度離心方法操作簡單方便,成本低,一次處理細(xì)胞數(shù)量多。Percoll是一種外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅膠顆粒,以它作為密度梯度分離劑的優(yōu)點(diǎn)是無毒,無刺激性,對細(xì)胞無吸附作用,產(chǎn)生的滲透壓很小,在全部密度范圍保持相等張力。Percoll密度梯度離心法主要根據(jù)細(xì)胞之間密度差異分離細(xì)胞。細(xì)胞在連續(xù)密度梯度的分離介質(zhì)中,受強(qiáng)離心力的作用,最后會(huì)到達(dá)與其密度相同的分離介質(zhì)層面,并能保持平衡。在非連續(xù)的梯度中,分離的細(xì)胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度交界面上或密度層內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)通過采用Percoll密度梯度離心法對小鼠味蕾細(xì)胞進(jìn)行純化,獲得了較好的效果,純化后的細(xì)胞純度在65%以上(P<0.01),而且細(xì)胞存活率達(dá)到94.71%。細(xì)胞經(jīng)消化后形態(tài)趨于圓形,培養(yǎng)后味蕾細(xì)胞的形態(tài)異于體內(nèi)形態(tài)。為了證明培養(yǎng)的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞,通過透射電鏡技術(shù)對其進(jìn)行鑒定,結(jié)果從精細(xì)結(jié)構(gòu)上證明了純化的細(xì)胞為味蕾細(xì)胞。但由于味蕾細(xì)胞包含4種類型的細(xì)胞,而CK 8不能標(biāo)記所有味蕾細(xì)胞,這也許是導(dǎo)致純化后細(xì)胞純度偏低的主要原因。

3 結(jié) 語

總之,作者已經(jīng)初步建立了一種有效的小鼠味蕾細(xì)胞分離純化方法,通過Percoll密度梯度離心法從小鼠舌上皮組織中富集形態(tài)和活力良好的味蕾細(xì)胞。應(yīng)用純化的味蕾細(xì)胞可以開展甜味感受熱力學(xué)和細(xì)胞傳感器方面的研究,并結(jié)合膜片鉗和鈣影像技術(shù)研究味蕾細(xì)胞的生理生化特性。

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(責(zé)任編輯:朱明)

Development of a Discontinuous Percoll Gradient Centrifugation Process for Taste bud Cells Purification

WANG Teng-hao1, QIN Yu-mei1, ZHANG Gen-hua2, DENG Shao-ping＊1
(1.College of Food Science and Biotechnology Engineering,Sensory Science Laboratory,Zhejiang Gongshang Uni
versity,Hangzhou 310035,China;2.College of Food Science and Biotechnology,Changshu Institute of Technolo
gy,Changshu 215500,China)

In this manuscript,the taste bud cells of fungiform papillae of ICR mice were select as research model and Percoll gradient centrifugation was used as purify method.The methods of trypan blue staining and immunohistochemistry staining were performed to compare the viability and purity of taste bud cells of before and after purification respectively.Taste bud cells were further identified by transmission electron microscopy.Results showed that taste bud cells, which were purified by discontinuous Percoll gradient centrifugation,were remarkably separated and mainly located interface between 20%and 40%Percoll working solution;the purity of taste bud cells were distinctly improved from less than 10%to more than 65%(p<0.01)by this treatment;the viability of taste bud cells were up to 94%after purification by trypan blue staining and the results of transmission electron microscopy further confirmed taste bud cells from ultrastructure.

taste bud cells,purification technology,Percoll,ultrastructure

Q 434

:A

1673-1689(2010)01-0118-05

2009-03-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770536);浙江省科技廳新苗人才項(xiàng)目(2008R40G2050028);浙江工商大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金(1110XJ1508066).

＊通訊作者:鄧少平(1956-),男,江西新干人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品感官科學(xué)方面的研究。Email:spdeng@zjgsu.edu.cn