李文明, 劉洪濤, 李佳佳, 張吉, 石磊, 于超＊

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶 400016;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧大連 116023)

川芎有效成分的體外抗氧化研究

李文明1, 劉洪濤2, 李佳佳1, 張吉1, 石磊1, 于超＊1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶 400016;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧大連 116023)

探討研究了天然藥用植物川芎(L igusticum chuanxiongHort.)根莖內(nèi)有效成分—川芎嗪的體外自由基清除活性,以及對過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞氧化損傷的抑制作用。流式細胞儀檢測川芎嗪對H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生的抑制作用;Griess法測定川芎嗪對一氧化氮(NO)的清除能力;比色法測定川芎嗪對羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、DPPH自由基(· DPPH)及脂質(zhì)過氧化的清除能力。川芎嗪可抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P< 0.05),具有顯著的OH·清除能力,并且對DPPH·、NO、H2O2及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均具有一定的清除能力。具有一定的自由基清除活性并可抑制內(nèi)皮細胞的氧化損傷。

川芎嗪;氧化應(yīng)激;自由基;血管內(nèi)皮細胞

自由基是人體組織中許多生化反應(yīng)的中間代謝物,一般情況下,自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡,機體存在著完善的自由基清除系統(tǒng),但在某些病理情況下(如動脈粥樣硬化),這種平衡被打破,致使機體損傷,機體產(chǎn)生的的自由基不能被及時消除,活潑的自由基與不飽和脂肪酸反應(yīng),最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

因此改善細胞功能,保護內(nèi)皮細胞免受損傷,是預(yù)防和治療血管性疾病的一種重要手段。在諸多因素導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷的過程中,氧化應(yīng)激參與了其中的多個環(huán)節(jié),所以天然藥用植物來源的有效抗氧化成分在防治細胞損傷方面的特性和作用一直備受重視。

川芎為天然藥用植物川芎L igusticum chuanxiongHort.的根莖,屬傘形科藁本屬,多產(chǎn)于四川、江西、湖北等一帶,具有活血化淤作用。川芎嗪(tetramenthylpyrazine)是川芎中的有效單體之一,屬生物堿類,可降低人體的血脂質(zhì)過氧化物[1],抑制2,2-聯(lián)苯-1-苦基肼(DPPH)或次黃嘌呤(HX)+黃嘌呤氧化酶(XO)誘導(dǎo)內(nèi)、外源性自由基對大鼠離體心臟模型所致的心肌損傷[2];抑制家兔紅細胞自氧化和H2O2所致紅細胞溶血,并能抑制肝勻漿自發(fā)性和Fe2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[3]。川芎嗪具有一定的體內(nèi)抗氧化功效,但川芎嗪對自由基清除作用原理尚不十分清楚,為進一步探索其對各種自由基的作用方式,通過建立體外抗氧化模擬體系及細胞學(xué)實驗?zāi)Ｐ?研究了其有效成分川芎嗪對自由基的清除能力,為揭示川芎嗪的抗氧化機理提供一定的理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

川芎嗪、DMSO購于美國Sigma公司;DMEMF12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司;胞內(nèi)ROS熒光探針(DCFH-DA)購于碧云天生物技術(shù)研究所;2,2-聯(lián)苯-1-苦基肼貯存液(DPPH)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、2-脫氧核糖、亞麻酸、硝普鈉、硫氰酸銨、氯化亞鐵、2-硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗壞血酸、過氧化氫購于阿拉丁試劑(中國)有限公司,其它試劑均為分析純購于商業(yè)試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NO清除能力試驗 川芎嗪對NO清除能力參照文獻[4]的方法。取不同質(zhì)量濃度的川芎嗪甲醇溶液(50～800 mg/L,以下相同)1.8 mL與0.2 mL硝普鈉(2.5 mmol/L)充分混勻,25℃光照下準(zhǔn)確反應(yīng)2 h,之后取上清液,采用Griess法于540 nm波長下測定川芎嗪對NO清除能力,空白管為1.8 mL雙蒸水加0.2 mL硝普鈉(1.2.2 OH·清除能力的試驗 2.5 mmol/L)。

參照文獻[5-7]并略加以改進,采用比色法測定川芎嗪對Fenton體系產(chǎn)生的·OH清除作用。將不同濃度的川芎嗪(50～800 mg/L)加入Fenton體系(終濃度為3 mmol/L 2-脫氧核糖、0.1 mmol/ L FeCl2、1 mmol/L H2O2、0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L抗壞血酸)中充分混勻并用0.02 mol/L PBS補足3 mL,于37℃準(zhǔn)確反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢,分別加入1 mL三氯乙酸(2.8%)及1 mL TBA (1%),充分混勻后將各樣品管于100℃加熱20 min。加熱完畢,取出各樣品管,流水冷卻后,于532 nm下測定其吸光度值,并按下述公式計算川芎嗪對OH·的百分清除率。

OD對照為未加TMP時測得的OD值;OD空白為Fenton體系中只加2-脫氧核糖時測得的OD值; OD樣本為加入不同濃度TMP時測得的OD值。

1.2.3 DPPH·自由基清除試驗 參照文獻[8-9]的方法,采用比色法測定川芎嗪對DPPH·清除作用。將不同的濃度川芎嗪(50～800 mg/L)與1 mL濃度為90μmol/L的DPPH溶液混勻后加甲醇至4 mL,室溫準(zhǔn)確反應(yīng)60 min后于515 nm下測定其吸光度值,并按下述公式計算川芎嗪對DPPH ·的百分清除率。

OD對照為未加TMP時測得的OD值;OD空白為未加DPPH時測得的OD值;OD樣本為加入不同濃度TMP時測得的OD值。

1.2.4 抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的試驗 川芎嗪抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的測定參照文獻[10]采用比色法。將1 mL乙醇(99.5%)與13μL亞麻酸于10 mL離心管中混勻后,加入1 mL待測樣品(對照管加入1mL去離子水)與0.5 mL PBS(p H 7.0),混勻,40℃,避光孵育24 h,之后取反應(yīng)混合物100μL與4.9 mL硫氰酸鐵反應(yīng)體系(4.7 mL 75%的乙醇、0.1 mL 30%的硫氰酸銨及0.1 mL的2×10-2mol/ L氯化亞鐵)充分混勻,準(zhǔn)確反應(yīng)3 min后于500 nm下測定其吸光度值,并按下述公式計算川芎嗪對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制率(A及A0分別代表樣品及空白對照的吸光度)。

1.2.5 過氧化氫的清除率試驗 過氧化氫清除率的測定按照文獻[11]的方法進行。取不同質(zhì)量濃度的川芎嗪(50～800 mg/L)各200μL與0.6 mL H2O2(40 mmol/L)混勻,室溫準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后于230 nm波長下測定其吸光度值,并按下述公式計算川芎嗪對H2O2的百分清除率。

OD對照為未加TMP時測得的OD值;OD空白為未加H2O2時測得的OD值;OD樣本為加入不同濃度TMP時測得的OD值。

1.2.6 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基(含105U/L青霉素,105U/L鏈霉素,30 mg/L內(nèi)生長因子添加物及5×103U/L肝素)中,置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng),待細胞80%融合時,用0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化傳代。

1.2.7 胞內(nèi)ROS的清除能力試驗 細胞內(nèi)總ROS水平采用ROS的特異性熒光探針DCFH-DA測定[12],當(dāng)DCFH-DA進入細胞內(nèi)后可與細胞內(nèi)活性氧結(jié)合生成具有熒光的DCFH。細胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的川芎嗪(50、100、200 mg/L)孵育4 h后,加H2O2(750μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)20 h,去除培養(yǎng)液,PBS(p H 7.4)洗2遍,加20μM的ROS熒光探針(DCFH-DA)37℃避光孵育2 h,用PBS(p H 7.4)洗2遍,收集細胞后流式細胞儀(FACS Vantage SE,Becton Dickinson, USA)分析細胞內(nèi)的熒光強度,選擇激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長530 nm,之后做細胞滴片于熒光顯微鏡下觀測ROS熒光變化。

在哲學(xué)常識課的教學(xué)過程中，如何做到哲理教育與情趣教育的有機結(jié)合呢?在教學(xué)實踐中，我主要從以下幾個方面進行了嘗試，收到了較好的教育、教學(xué)效果。

1.2.8 統(tǒng)計分析 每批試驗至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS11.0軟件分析,兩組間差異用Student’s.t.檢驗分析,多組間比較用方差分析法處理數(shù)據(jù),P<0.01或P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析川芎嗪體外抗氧化試驗

川芎嗪甲醇溶液的紫外可見吸收光譜圖見圖1。從圖1可以看出,在230 nm波長處川芎嗪光吸收微弱,根據(jù)公式計算清除率時,可以排除干擾。川芎嗪在500、515、532及540 nm處均無明顯吸收,因此在上述波長下測定時,不會對測定結(jié)果造成干擾,故可用比色法測定川芎嗪對H2O2、脂質(zhì)過氧化、DPPH·、OH·和NO清除能力。

圖1 川芎嗪波長掃描圖Fig.1 Wavelength scanogram of TMP

2.2 NO的清除能力分析

NO在體內(nèi)由一氧化氮合酶催化L-精氨酸生成,正常情況下,NO作為第二信使發(fā)揮其生理功能,當(dāng)機體處于病理情況(如氧化應(yīng)激),NO可與體內(nèi)其它自由基結(jié)合生成氧化性更強的過氧化亞硝基陰離子,從而對機體造成更大的危害[13],因此,要考察川芎嗪的抗氧化能力,測定其對NO的清除能力是非常必要的。本研究采用硝普鈉作為NO供體,前者在光照條件下產(chǎn)生NO+形式存在的NO,產(chǎn)生NO的量用Griess法測定。如圖2所示,在所取的質(zhì)量濃度范圍(50～800 mg/L)內(nèi),川芎嗪對NO具有一定的清除作用,且具有一定的濃度依賴性。

圖2 川芎嗪對NO的清除Fig.2 NO scavenging activity of TMP

2.3 自由基的清除能力分析測定

2.3.2 DPPH·的清除能力分析 二苯基苦味肼自由基(DPPH·)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其甲醇溶液呈紫色,在515 nm波長處有最大吸收峰。由于自由基清除劑與其單電子配對而使其吸收逐漸消失,在一定范圍內(nèi)褪色程度與其所接受的電子有定量關(guān)系,可以反映出試樣清除穩(wěn)定自由基的能力,因此已經(jīng)成為評價抗氧化劑清除自由基能力的常用方法[14-16]。

本研究采用比色法,測定了50～800 mg/L不同質(zhì)量濃度下川芎嗪對DPPH·的清除能力,實驗結(jié)果見圖3 B。由圖3 B可知,川芎嗪在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH·具有一定的清除作用,且對DPPH·的清除能力具有典型的量效關(guān)系。與川芎嗪的清除羥自由基能力相比,其對DPPH·清除能力較弱。

2.3.3 抗脂質(zhì)過氧化能力分析 亞麻酸屬多不飽和脂肪酸,是構(gòu)成人體組織細胞的主要成分,常用于脂質(zhì)氧化與抗氧化相關(guān)分析。本研究中,如圖3 C所示,川芎嗪對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制效果不明顯。這與張兆輝[17]等人結(jié)果有些矛盾,可能是由于所用的川芎嗪的劑量、脂質(zhì)過氧化系統(tǒng)以及檢測方法不同而造成的。

2.3.4 H2O2的清除能力分析 川芎嗪對H2O2的清除能力采用比色法測定。川芎嗪的質(zhì)量濃度為50、100、200、400、800 mg/L。如圖3 D所示,在所取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),川芎嗪對H2O2清除作用不明顯,提示前者在用于H2O2所致的氧化應(yīng)激損傷研究中,可與H2O2同時給藥而不影響結(jié)果的可靠性。

圖3 川芎嗪對自由基的清除Fig.3 Free radical scavenging activity of TMP

2.4 抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生分析

目前被普遍接受的Ross修正的“炎癥學(xué)說”認(rèn)為,動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,如氧化應(yīng)激、高血壓、炎癥以及感染等因素均可導(dǎo)致血管損傷,促使動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,而內(nèi)皮細胞功能障礙又是動脈粥樣硬化形成早期的始動環(huán)節(jié)。因此選用被普遍接受的研究動脈粥樣硬化內(nèi)皮細胞模型——人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為研究對象。

過氧化氫作為胞內(nèi)ROS的一種,經(jīng)常作為外源性刺激制造氧化應(yīng)激損傷模型,以此來考察氧化應(yīng)激損傷發(fā)生時細胞以至機體發(fā)生的一系列應(yīng)激改變,同時由于體外化學(xué)模型證實川芎嗪與H2O2不產(chǎn)生交叉反應(yīng),因此,川芎嗪完全可以應(yīng)用于過氧化氫所致的氧化應(yīng)激損傷模型中?；诖?本研究采用過氧化氫刺激的內(nèi)皮細胞作為模型,考察川芎嗪對氧化應(yīng)激損傷的保護作用。如圖4流式檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2(750μmol/L)刺激20 h后,胞內(nèi)ROS水平比正常增高約4.7倍(P<0.01),而預(yù)先加入不同濃度的川芎嗪(50～200 mg/L)預(yù)保護4 h后再加H2O2(750μmol/L),胞內(nèi)ROS水平與模型組相比則有不同程度的下降,分別下降16.11%(P <0.05)、35.64%(P<0.01)、19.26%(P<0.05)。另外通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)熒光強度變化與流式所得結(jié)果相同(見圖5)。

圖4 流式檢測川芎嗪抑制胞內(nèi)R OS的產(chǎn)生(X ±S.n=3)Fig.4 Inhibitory effect of TMP on the production of in tracellular ROS analyzed by flowcytometry

圖5 熒光分析川芎嗪對胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的抑制作用(X ±S.n=3)Fig.5 Inhibitory effect of TMP on the production of intracellular ROS analyzed by fluorescent quantitation

由此可以看出,雖然川芎嗪對H2O2清除能力欠佳,但它可以抑制H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,這提示我們川芎嗪可能是通過其他途徑(如上調(diào)細胞內(nèi)某些抗氧化酶的水平)來抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減輕細胞的氧化損傷。

3 結(jié) 語

研究通過體外抗氧化體系從抑制NO、OH·、H2O2、DPPH·及脂質(zhì)過氧化等方面證明了川芎嗪的自由基清除能力:在所取的濃度范圍內(nèi)(50-800mg/L),川芎嗪對OH·的清除率都超過50%,具有顯著的清除作用,對NO、DPPH·具有一定的清除作用且濃度依賴關(guān)系較明顯,對脂質(zhì)過氧化及過氧化氫的清除能力較對羥自由基清除能力弱,另外流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)川芎嗪對過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞胞內(nèi)ROS的生成具有顯著的抑制作用。綜上所述,川芎嗪具有一定的體外自由基清除活性,并能抑制過氧化氫誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS的生成。

[1]王倩,汪海.具有抗動脈粥樣硬化作用的天然藥物及其單體化合物[J].世界科學(xué)技術(shù)—中藥現(xiàn)代化,2002,4(5):52-58.

WANG Qian,WANG Hai.Natural medicines and their monomers with anti-atherosclerosis effects[J].World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine,2002,4(5):52-58.(in Chinese)

[2]劉紅,艾明仙,陽輝.川芎嗪對自由基致大鼠離體心臟損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床,2007,23(5):68-70.

LIU Hong,AI Ming-xian,YANG Hui.Protective effects of tetramethylpyrazine on free radicle-induced injury in isolated rat heart[J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica,2007,23(5):68-70.(in Chinese)

[3]劉曉麗,霍展樣,張金蓮.鹽酸川芎嗪體外抗氧化作用的研究[J].中國航天醫(yī)藥雜志,2003,5(2):37-39.

LIU Xiao-li,HUO Zhan-yang,ZHANGJin-lian.Antioxidative activity of ligustrazine in vitro[J].Medical Journal of CASE,2003,5(2):37-39.(in Chinese)

[4]Meng Xue-lian,Yang Jing-yu,Chen Guo-liang,et al.RV09,a novel resveratrol analogue,inhibits NO and TNF-alpha production by LPS-activated microglia[J].International Immunopharmacology,2008,8(8):1074-1082.

[5]Singh HP,Mittal S,Kaur S,et al.Chemical composition and antioxidant activity of essential oil from residues of Artemisia scoparia[J].Food Chemistry,2009,114(2):642-645.

[6]Xing Ronge,Yu Hua-hua,Liu Song,et al.Antioxidant activity of differently regioselective chitosan sulfates in vitro[J]. Bioorganic&Medicinal Chemistry,2005,13(4):1387-1392.

[7]呂曉玲,朱惠麗,姜平平,等.紫蘇提取物抗氧化活性體外實驗研究[J].中國食品添加劑,2003,5:22-25.

LüXiao-ling,ZHU Hui-li,J IANG Ping-ping,et al.In vitro Antioxidant Activity of Perillae Leaves Extract[J]. China Food Additives,2003,5:22-25.(in Chinese)

[8]Bozin B,Mimica-Dukic N,Simin N,et al.Characterization of the volatile composition of essential oils of some lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the entire oils[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006;54(5):1822-1828.

[9]Liu Shih-chuan,Lin Jau-tien,Wang Chin-kun,et al.Antioxidant properties of various solvent extracts from lychee(Litchi chinenesis Sonn.)flowers[J].Food Chemistry,2009,114:577-581.

[10]Huang Rong-hua,Mendis E,Kim SK.Factors affecting the free radical scavenging behavior of chitosan sulfate[J].International Journal of Biological Macromolecules,2005,36(1-2):120-127.

[11]Ruch RJ,Cheng Shu-jun,Klaunig J E.Prevention of cytotoxicity and inhibition of intercellular communication by antioxidant catechins isolated from Chinese green tea[J].Carcinogenesis,1989,10(6):1003-1008.

[12]Liu Hong-tao,Li Wen-ming,Xu Gang,et al.Chitosan oligosaccharides attenuate hydrogen peroxide-induced stress injury in human umbilical vein endothelial cells[J].Pharmacological Research,2009,59(3):167-75.

[13]Cai H.Hydrogen peroxide regulation of endothelial function:origins,mechanisms,and consequences[J].Cardiovasc Res,2005,68:26-36.

[14]Cotclle N,Bemier JL,Cattcau J P,et al.Antioxidant properties of hydroxyl-flavones[J].Free Radical Biology and Medicine,1998,20(1):35-43.

[15]Cavin A,Hostettmann K,Dyatmko,et a1.Antioxidant and lipophilic constituents of tinospora crispa[J].Planta medica, 1998,64:393-396.

[16]陸健,樊偉,孔偉寶,等.大麥總多酚不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008, 27(1):57-61.

LU Jian,FAN Wei,KONG Wei-bao,et al.Study on the extraction of total polyphenol in Barley(Hordeum vulgare L.) and its ability on scavenging DPPH free radical[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008,27(1):57-61.(in Chinese)

[17]Zhang Zhao-hui,Yu Shao-zu,Wang Zhen-tao,et al.Scavenging effects of tetramethylpyrazine on active oxygen free radicals[J].Acta Pharmacologica Sinica,1994,15(3):229-231.

(責(zé)任編輯:楊萌)

Isolation and Antioxidative Activity of the Substrate Isolated from Chuanxiong

LI Wen-ming1, LIU Hong-tao2, LI Jia-jia1, ZHANGJi1, SHI Lei1, YU Chao＊1
(1.Institute of Life Science,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Dalian Institue of Chemical Physics,Chinese Academy of Science,Dalian 116023,China)

The objective of this study is to investigate scavenging activity of tetramethylpyrazine (TMP),an effective constituent isolated from the rhizome of nature medicinal plantL igusticum chuanxiongHort.,on free radicals in vitro and inhibitory effect of TMP on H2O2-induced oxidative damage of endothelial cells.The inhibition ofH2O2-induced intracellular reactive oxygen species(ROS)by TMP was analyzed on a FACS Vantage SE flow cytometer.The suppressive effect of TMP on nitric oxide(NO)production was measured by Griess method.The scavenging effect of TMP on free radicals including hydroxyl radical(·OH),hydrogen peroxide (H2O2),DPPH free radicle(DPPH·)and lipid peroxidation free radical was determined by colorimetry method.It was found that TMP inhibited H2O2-induced production of intracellular ROS and exhibited strong scavenging activity against hydroxyl radical.In addition,TMP displayed scavenging activity against DPPH·,NO,H2O2and lipid peroxidation.The results presented here indicated that TMP may exhibit scavenging activity on free radicals in vitro andinhibitory effect on oxidative damage of endothelial cells.

tetramethylpyrazine,oxidative stress,free radical,vascular endothelial cell

O 629.32;R 285.5

:A

1673-1689(2010)01-0064-07

2009-02-25

重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項目資助(NO KJ070304);重慶醫(yī)科大學(xué)人才啟動基金資助項目(No 0200100263)。

＊通訊作者:于超(1963-),男,遼寧沈陽人,醫(yī)學(xué)博士,教授,主要從事天然藥物分析與研究。Email:yuchaom@ 163.com