金晶, 徐志宏＊, 魏振承, 謝筆鈞, 劉軍

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所,廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實驗室,廣東廣州 510610;

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

雙酶分步水解制備菜籽蛋白肽

金晶1,2, 徐志宏＊1,2, 魏振承1, 謝筆鈞2, 劉軍1,2

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所,廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實驗室,廣東廣州 510610;

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

實驗選取Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步水解菜籽蛋白。結(jié)果表明雙酶分步水解制備菜籽肽的最佳工藝為Alcalase堿性蛋白酶在p H值9.5,溫度55℃,底物質(zhì)量分數(shù)3%,酶活性5 500 u/g條件下酶解5.5 h,水解度為21.14%,再用復(fù)合風(fēng)味酶在p H值6,溫度50℃,酶活性900 u/g條件下繼續(xù)酶解3 h。單因素試驗和正交實驗研究粗肽液用活性炭脫色的優(yōu)化條件為:在活性炭質(zhì)量分數(shù)1.5%,p H值4.5,溫度55℃條件下脫色50 min,脫色率達32.15%,氨基酸損失率為25.15%。

菜籽蛋白;Alcalase堿性蛋白酶;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶;水解

菜籽蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白,生物效價和營養(yǎng)價值比大豆、花生、棉籽等其他植物蛋白高,水解后制備成具有生理活性的菜籽蛋白肽的生物效價和營養(yǎng)價值更高。堿性蛋白酶(Alcalase)是一種高效的細菌蛋白酶,主要用于水解各種蛋白質(zhì),該酶的主要有效成分枯草桿菌蛋白酶A是一種內(nèi)切蛋白酶。而且Alcalase堿性蛋白酶具有高度的操作安全性[1]。復(fù)合風(fēng)味酶(Flavourzyme)是一種用于中性或微酸性條件下水解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶/肽酶的復(fù)合體,該酶可用于脫除低水解讀產(chǎn)物的苦味,同時也可用于水解蛋白質(zhì),增進和改善水解液的風(fēng)味[2]。由于不同的酶它們的最適p H值,最適溫度不一樣,為了使它們達到最佳的水解效果,一般采取分步酶水解的方法。本實驗選用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味酶對菜籽蛋白進行分步酶水解,結(jié)果表明利用此兩種酶進行酶解可有效提高水解度以及減少菜籽多肽的苦味。

菜籽蛋白經(jīng)堿性蛋白酶解后其溶解性得到了改善,經(jīng)風(fēng)味復(fù)合酶酶解后其苦味值降低,但其色澤較深,氣味較重,需要進行脫色脫異味處理。活性炭具有很大的比表面積,當(dāng)被脫除的有色物質(zhì)的分子直徑小于或等于活性炭的入孔直徑時可被活性炭吸附而起到脫色效果,同時,活性炭還兼具脫臭的效果[3]。本實驗采用粉末活性炭作為吸附劑對菜籽蛋白酶解液進行脫色實驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菜籽蛋白:作者自制,蛋白質(zhì)量分數(shù)83.67%;堿性蛋白酶Alcalase 2.4L(活力95 000 U/g):丹麥NOVO公司產(chǎn)品。Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶500MG(活力為7740U/g):丹麥NOVO公司產(chǎn)品。其它所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要試驗儀器

臺式離心機:TDL-5型,上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);p H計:phs-3C型,上海理達儀器廠生產(chǎn);分析天平:FA2004型,上海精科天平廠產(chǎn)品;分光光度計:UV-1700,Sigma公司產(chǎn)品,美國;冷凍干燥機: FD-1,北京博醫(yī)康實驗儀器公司生產(chǎn);恒溫水浴振蕩器:SHA-C,金壇市精達儀器制造廠生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶活力測定 福林-酚法,見參考文獻[4]。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度(DH)測定 p H-stat法,見參考文獻[5]。

1.3.3 氨基態(tài)氮測定 甲醛快速滴定法,見參考文獻[6]。

1.3.4 苦味值的測定 感官評定法,見參考文獻[7]。

1.3.5 酶解方法

配制一定濃度的菜籽蛋白溶液,水浴至實驗設(shè)定的溫度,用1 mol/L的NaOH調(diào)p H至實驗設(shè)定值,加入適量的堿性蛋白酶并低速攪拌。在反應(yīng)過程中以0.1 mol/L的NaOH維持p H值恒定(± 0.1 p H值單位),水解至預(yù)定時間后,酶解液置沸水浴10 min鈍化堿性蛋白酶,冷卻到2次酶解所需的溫度,調(diào)p H值,加入適量的復(fù)合風(fēng)味酶,低速攪拌,水解至預(yù)定時間后至沸水浴中鈍化復(fù)合風(fēng)味酶, 5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液于燒杯中,冷凍干燥[8-10]。

1.3.6 脫色研究方法 在菜籽蛋白肽液中加入一定量的活性炭吸附劑,用1 mol/L的NaOH調(diào)p H值,設(shè)定脫色溫度,在水浴恒溫振蕩器中振蕩一定的時間,過濾水解液,上清液在波長為400 nm處測定其吸光度,按下列公式計算脫色率[3,11];同時上清液在波長為280 nm處測定其吸光度,按下列公式計算氨基酸損失率:

2 結(jié)果與分析

2.1 酶水解條件的試驗研究

2.1.1 酶活力對酶解菜籽蛋白水解度的影響 在不同的酶濃度下,p H值為8,溫度50℃,底物質(zhì)量分數(shù)3%,酶解180 min,測定水解度,結(jié)果見圖1。

圖1 酶濃度對水解度的影響Fig.1 Effect of[E]on hydrolysis rate

隨著酶活力的增加,水解度也隨之增加,當(dāng)酶活力達到5 000 u/g時,水解度達到最大,當(dāng)酶濃度繼續(xù)增加時,水解度變化不大,考慮到成本等經(jīng)濟

原因,故選擇酶活力5 000 u/g。

2.1.2 p H值對酶解菜籽蛋白水解度的影響 在不同的p H條件下,酶濃度5 000 u/g,溫度50℃,底物質(zhì)量分數(shù)3%,酶解180 min,測定水解度,結(jié)果見圖2。

圖2 pH對水解度的影響Fig.2 Effect of pHon hydrolysis rate

由圖2可知,隨著p H值的增大,水解度逐漸增大,到p H值9.5時達到最大,繼續(xù)增加p H值時,由于過高的p H值降低了酶的活性,水解度降低,且酶解液顏色顯著加深,氣味也顯著加重,故選擇p H值為9.5。

2.1.3 底物質(zhì)量分數(shù)對酶解菜籽蛋白水解度的影響 在不同的底物濃度下,酶濃度5 000 u/g,p H值9.5,溫度50℃,酶解180 min,測定水解度,結(jié)果見圖3。

圖3 底物濃度對水解度的影響Fig.3 Effect of concentration of substrate on hydrolysis rate

由圖3可知,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)在3%時,水解度最大,故選擇底物質(zhì)量分數(shù)為3%。

2.1.4 溫度對酶解菜籽蛋白水解度的影響 在不同的溫度下,酶活力5 000 u/g,p H 9.5,底物質(zhì)量分數(shù)3%,酶解180 min,測定水解度,結(jié)果見圖4。

由圖4可知,隨著溫度的上升,水解度逐漸增大,當(dāng)溫度在45℃～55℃時,水解度達到最大且相對穩(wěn)定,繼續(xù)升高溫度,酶的活性受到了抑制,使水解度逐漸降低。綜合考慮,選擇酶解溫度50℃。

圖4 溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.1.5 水解時間對酶解菜籽蛋白水解度的影響酶濃度5 000 u/g,p H值9.5,底物質(zhì)量分數(shù)3%,溫度50℃,酶解不同的時間,測定水解度,結(jié)果見圖5。

圖5 酶解時間對水解度的影響Fig.5 Effect of time on hydrolysis rate

由圖5可知,隨著水解時間的延長,水解度不斷增加,在酶解4 h后水解度增加緩慢,水解5 h,水解度達到最大,繼續(xù)水解,水解度增加不明顯,考慮到經(jīng)濟原因,故選取酶解時間為5 h。

2.1.6 堿性蛋白酶酶解正交實驗 在單因素的實驗基礎(chǔ)上,固定底物質(zhì)量分數(shù),以p H值、酶濃度、酶解時間和提取溫度為因素,設(shè)計L9(34)正交實驗,實驗方案和結(jié)果見表1。

表1 正交實驗方案與結(jié)果分析Tab.1 The result of orthogonal experiment

續(xù)表1

由表1可見,對水解度影響對大的是p H值,酶解時間和酶濃度次之,溫度影響最小。最優(yōu)組合是A3B2C3D3,因為此組合不在正交表中,故需做一組最優(yōu)組合的實驗,即在酶解活力為5 500 u/g,p H值9.5,酶解溫度55℃條件下酶解5.5 h,測得的水解度為21.14%。

2.2 復(fù)合風(fēng)味酶對菜籽蛋白的Alcalase堿性蛋白酶水解物的繼續(xù)水解作用

2.2.1 復(fù)合風(fēng)味酶酶活力對2次酶解的影響 在不同的復(fù)合風(fēng)味酶酶濃度條件下,p H值6.0,溫度50℃,酶解1 h,以每mL水解液中游離氨基氮含量和苦味值為指標(biāo),結(jié)果如圖6。

圖6 復(fù)合風(fēng)味酶酶濃度對二次酶解的影響Fig.6 Effect of Flavourzyme[E]on the second hydrolysis

由圖6可知,隨著復(fù)合風(fēng)味酶濃度的增加,游離氨基氮的含量逐漸增加,苦味也在逐漸減輕,酶活力到900 u/g時,游離氨基氮含量達到最大,再增加酶濃度,游離氨基氮含量增加不顯著,苦味減輕也不顯著。故選擇復(fù)合風(fēng)味酶濃度為900 u/g。

2.2.2 p H值對2次酶解的影響 在不同的p H條件下,酶活力900 u/g,溫度50℃,酶解1 h,以每毫升水解液中游離氨基氮含量和苦味值為指標(biāo),結(jié)果如圖7。

圖7 pH對二次酶解的影響Fig.7 Effect of pHon the second hydrolysis

由圖7可知,p H值在6～7的范圍內(nèi),游離氨基氮的變化不顯著,在p H值為6時,游離氨基氮含量最大,p H過大或過小都不利于復(fù)合風(fēng)味酶二次酶解菜籽蛋白。同時,p H過高或過低都無法使酶解液的苦味減輕,故選取2次酶解的p H值為6。

2.2.3 酶解溫度對2次酶解的影響 在不同的酶解溫度下,p H值6.0,酶濃度900 u/g,酶解1 h,以每mL水解液中游離氨基氮含量和苦味值為指標(biāo),結(jié)果如圖8。

圖8 酶解溫度對2次酶解的影響Fig.8 Effect of temperature on the second hydrolysis

由圖8可知,游離氨基氮含量先隨著溫度的增加而增加,當(dāng)溫度達到50℃時,游離氨基氮含量達到最大,溫度繼續(xù)上升時,游離氨基氮含量慢慢減少,酶解液苦味恰好相反,過低或過高的溫度都無法達到減輕酶解液苦味值的效果,故選取50℃為2次酶解的溫度。

2.2.4 酶解時間對二次酶解的影響 p H值6.0,酶解溫度50℃,酶活力900 u/g,酶解不同的時間,以每毫升水解液中游離氨基氮含量和苦味值為指標(biāo),結(jié)果如圖9。

圖9 酶解時間對二次酶解的影響Fig.9 Effect of time on the second hydrolysis

由圖9可知,酶解前3 h,游離氨基氮含量隨著酶解時間的延長迅速增加,3 h后,游離氨基氮含量增加緩慢,菜籽肽的苦味值在酶解3 h后達到最小,繼續(xù)酶解,苦味值不發(fā)生明顯的改變。綜合考慮,故選擇酶解時間為3 h。綜上所述,菜籽肽酶分步酶解工藝為先用A lcalase堿性蛋白酶在水解條件為:A lcalase堿性蛋白酶酶濃度為5 500 u/g,溫度55℃,p H值為9.5,菜籽蛋白質(zhì)量分數(shù)3%酶解5.5 h,然后用復(fù)合風(fēng)味酶在p H值6.0,酶解溫度50℃,酶活力900 u/g的條件下酶解3 h,得到游離氨基氮含量較高,苦味值較低的菜籽肽酶解液。

3 菜籽肽的脫色實驗

由于此時的菜籽肽酶解液顏色較深,且氣味較重,故需要進行脫色實驗,本實驗采用粉末活性炭作為吸附劑對肽液進行脫色實驗,根據(jù)單因素實驗得到一系列的單因素實驗結(jié)果,然后結(jié)合正交試驗得出最佳工藝,實驗設(shè)計方案和結(jié)果分析如表2、表3。

表2 正交試驗設(shè)計方案Tab.2 Design of orthogonal test

表3 正交實驗方案與結(jié)果分析Tab.3 The result of orthogonal experiment

由極差分析可知,對脫色實驗效果的影響p H值>時間>活性炭用量>溫度,由此可得出最優(yōu)脫色工藝,即正交實驗中的方案1,活性炭用量為質(zhì)量分數(shù)1.5%,p H值4.5,溫度55℃,時間50 min,脫色率可達32.15%,氨基酸損失率25.15%。

4 結(jié) 語

1)菜籽蛋白經(jīng)Alcalase2.4 L堿性蛋白酶在酶濃度5 500 u/g,p H值9.5,酶解溫度55℃的條件下酶解5.5 h,可得到水解度為21.14%肽液。

2)經(jīng)堿性蛋白酶酶解的菜籽肽液經(jīng)復(fù)合風(fēng)味酶在p H值6.0,酶解溫度50℃,酶濃度900 u/g的條件下酶解3 h,可得到游離氨基含量較高,苦味較低的菜籽多肽。

3)由于提取菜籽蛋白和酶解時所需的p H值較高,故酶解所得的菜籽肽顏色較深,且稍有難聞的氣味,故在活性炭用量為質(zhì)量分數(shù)1.5%,p H值4.5,溫度55℃條件下脫色50 min,得到較清亮的菜籽肽,此方法脫色率可達32.15%,氨基酸損失率25.15%。

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(責(zé)任編輯:楊萌)

Preparation Rapeseed Protein by Double Enzymes

Jin Jing1,2, XU Zhi-hong＊1,2, WEI Zhen-cheng1,
XIE Bi-jun2, LIU Jun1,2
(1.Agricultural Biotechnology Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Open Access Laboratory of Farm Product Processing,Guangzhou 510610,China;2.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

In this manuscript,the determination of optimum conditions of the rapeseed protein hydrolization was performed and the results listed as follows:hydrolyization time 5 hours with alcalase at p H 9.5,55℃,3%substrate and enzyme concentration 5500 u/g,the hydrolysis rate could reach to 21.14%,then hydrolization with flavourzyme for 3 hours at p H 6,50℃and enzyme concentration 900 u/g,the bitter value of rapeseed protein hydrolysates was very low under such conditions.The results of decoloration experiment of rapeseed protein hydrolysates with active carbon showed that the optimum conditions were:active carbon dosage 1.5%,p H 4.5,temperature 55℃,and reaction time 50 min,the decoloration rate could reach to 32.15%, and the amino acid loss rate was 25.15%under such conditions.

rapeseed protein,alcalase protease,flavourzyme,hydrolytic

TQ 936.1

:A

1673-1689(2010)01-0050-06

2009-02-24

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金項目(2006GBZE000219);廣東省科技計劃項目(2005B33701015)。

＊通訊作者:徐志宏(1965-),男,湖北黃岡人,研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。Email:zhihongxup@yahoo.com.cn