黃玉章 林 旋* 王全溪 謝建強 陳佳銘 趙 堇林樹根

(1.福建農林大學動物科學學院，福州 350002;2.上海朝翔生物技術有限公司，上海 201611)

黃芪為豆科植物膜莢黃芪和內蒙古黃芪的干燥根，其味甘、性溫，有補氣升陽、固表止汗、托毒排膿、利水消腫和生肌等功效，為補氣之要藥。現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)其藥理作用廣泛，能增強機體免疫功能、增強細胞代謝、調節(jié)DNA復制及RNA和蛋白質的合成，并具有固腎降壓、保肝抗炎等功能[1]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是黃芪的主要活性成分之一，其具有調節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗輻射和抗應激作用，在臨床上已經用于治療肝炎、腫瘤等疾病[2-3]。目前，黃芪多糖作為免疫增強劑和抗病毒藥物在畜牧業(yè)及水產養(yǎng)殖上已開始應用。

許多研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進單核巨噬細胞的功能，增強巨噬細胞的吞噬作用，提高自然殺傷細胞(NK)的活性。單核巨噬細胞系統(tǒng)能非特異性地吞噬侵入畜禽體內的病原體和有害異物，能將抗原提呈給T、B淋巴細胞從而參與機體的特異性免疫應答[4]。苗明三等[5]和單俊杰等[6]研究表明，黃芪多糖能增加小鼠腹腔巨噬細胞數(shù)量，顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能。

本試驗以羅非魚為研究對象，在羅非魚基礎飼料中分別添加不同劑量的黃芪多糖作為試驗組，以不添加黃芪多糖為對照組，飼喂羅非魚一段時間后解剖取材，應用組織化學染色方法觀察各組羅非魚腸道黏膜結構和腸道內相關免疫細胞的數(shù)量變化，探討黃芪多糖對羅非魚腸道免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與日糧

本試驗所用的羅非魚魚種由福建省淡水水產研究所提供。選用體長9 cm左右、平均體重為47 g的健康羅非魚150尾隨機分為5組，每組設3個重復，每個重復10尾。試驗組飼料分別在基礎飼料中添加500、1 000、1 500 、2 000 mg/kg 的黃芪多糖 ，以不添加黃芪多糖的基礎日糧作為對照組(0 mg/kg)。黃芪多糖由上海朝翔生物技術有限公司提供?；A日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗前羅非魚先集中馴養(yǎng)2周，試驗開始時，魚體稱重分組，注意將魚的體重調整至各組間差異不顯著(P＞0.05)，分別飼養(yǎng)在150 L水族箱里。試驗前用金益優(yōu)碘液消毒自來水1次，各組水質均為脫氯自來水，晝夜24 h用增氧機充氣。采用飽食的方式，每天08:00和16:00分別飼喂和換水1次，每次換水量約為50%，每天的飼料投喂量為羅非魚總體重的2%～4%，3 d調整1次。試驗期間水溫保持在27～29℃。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis，%)

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 取材與固定

試驗進行至40 d時，對各組羅非魚饑餓24 h后，從每組中隨機抽取5尾魚，按常規(guī)方法解剖，迅速取出羅非魚的前腸、中腸和后腸，各腸段長度約1 cm，浸入pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液洗掉內容物。Carnoy's固定液固定12～24 h，包埋并制作橫斷面切片。常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色和阿利新蘭-高碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色。

1.3.2 腸絨毛的形態(tài)觀察和測量

光鏡下觀察并應用圖象分析系統(tǒng)(IM50)，具體測量腸絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度。每個腸管取5張染色結果較好的切片進行拍照，每張切片隨機選取5根最長腸絨毛進行測量。

1.3.3 腸道免疫細胞的觀察與計數(shù)

光鏡下觀察各組羅非魚腸道內黏液細胞和上皮內淋巴細胞的分布與數(shù)量。

1.3.3.1 黏液細胞的計數(shù) 每個部位選擇5張著色較好的AB-PAS染色切片，每張切片均在40×10倍的光鏡下進行拍照觀察并計數(shù)，每張切片隨機抽取5根最長腸絨毛統(tǒng)計其中黏液細胞數(shù)量后取平均值。

1.3.3.2 上皮內淋巴細胞的計數(shù) 每個部位選擇5張著色較好的HE染色切片，每張切片均在40×10倍的光鏡下進行拍照觀察并計數(shù)，取每根腸管橫切面，選5根最長且排列整齊的腸絨毛，至少計算位于腸絨毛根部以上的上皮內淋巴細胞核，所有單核的非上皮細胞被認為是上皮內淋巴細胞，統(tǒng)計每l00個腸絨毛上皮柱狀細胞間上皮內淋巴細胞的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析進行生物學統(tǒng)計，各組間的差異顯著性采用兩組間獨立樣本雙尾T檢驗分析，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 黃芪多糖對羅非魚腸絨毛長度、隱窩深度、肌層厚度的影響

2.1.1 羅非魚腸絨毛長度的變化

由表2可知，各試驗組前腸、中腸和后腸的腸絨毛長度均比對照組長，且隨添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，前腸腸絨毛長度:1 000和1 500 mg/kg組比對照組分別增加了 36.62%和60.87%，差異極顯著(P＜0.01)，2 000 mg/kg組比對照組增加了16.69%，差異顯著(P＜0.05);中腸腸絨毛長度:1 000 mg/kg組比對照組增加了25.96%，差異顯著(P＜0.05)，1 500 mg/kg組比對照組增加了59.58%，差異極顯著(P＜0.01);后腸腸絨毛長度:1 000和1 500 mg/kg組相對于對照組增加了38.48%和 63.56%，差異極顯著(P＜0.01)。其余各組各腸段腸絨毛長度均與對照組差異不顯著(P＞0.05)。此外，在同一組中，羅非魚腸絨毛長度從前腸、中腸到后腸逐步降低，前腸腸絨毛長度最長，中腸次之，后腸最短。

2.1.2 羅非魚腸絨毛隱窩深度的變化

由表2可知，各試驗組前腸、中腸和后腸的隱窩深度均比對照組深，且隨添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，前腸和中腸隱窩深度:與對照組相比，1 500 mg/kg組極顯著增加(P＜0.01);1 000 mg/kg組顯著增加(P＜0.05);后腸隱窩深度:1 000和1 500 mg/kg組分別比對照組增加了23.35%和32.01%，差異顯著(P＜0.05)。其余各組各腸段腸絨毛隱窩深度均與對照組差異不顯著(P＞0.05)。此外，在同一組中，羅非魚腸絨毛隱窩深度變化與絨毛長度一樣由前腸、中腸到后腸逐步降低。

2.1.3 羅非魚腸絨毛肌層厚度的變化

由表2可知，各試驗組前腸、中腸和后腸的肌層厚度比對照組均有所增加，且隨添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，前腸肌層厚度:各試驗組與對照組相比均差異不顯著(P＞0.05);中腸肌層厚度:1 500 mg/kg組比對照組增加了36.43%，差異極顯著(P＜0.01);1 000 mg/kg組比對照組增加了26.22%，差異顯著(P＜0.05);后腸肌層厚度:1 000和1 500 mg/kg組分別比對照組增加了37.81%和45.36%，差異極顯著(P＜0.01)。其余各組各腸段腸絨毛肌層厚度均與對照組差異不顯著(P＞0.05)。另外，在同一組中，羅非魚腸絨毛肌層厚度中腸最大，后腸次之，前腸最小。

表2 羅非魚腸絨毛組織形態(tài)變化Table 2 Morphological changes of villus intestinal of tilapia (μ m)

2.1.4 羅非魚腸道黏膜的形態(tài)結構顯微觀察

腸黏膜層結構特點是有環(huán)形皺襞、腸絨毛和小腸腺，腸黏膜是腸道屏障的重要組成部分，它包括黏膜上皮、上皮之間的連接結構、上皮的基膜、細胞表面的細胞衣。在顯微鏡下觀察，各組羅非魚腸黏膜形態(tài)結構都較為完整，層次分明，腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰，染色鮮明，排列規(guī)則，2 000 mg/kg組腸絨毛頂端有稍微脫落的現(xiàn)象，但不嚴重。(見圖版1～5)

2.2 黃芪多糖對羅非魚腸道內黏液細胞分布及數(shù)量的影響

2.2.1 羅非魚腸道內黏液細胞的分布情況

羅非魚腸道組織經AB-PAS染色后，顯微鏡下觀察黏液細胞呈紅色、藍色、紫紅色和藍紫色。腸道各段上皮均有黏液細胞分布，黏液細胞主要有囊狀、梨狀和杯狀3種形態(tài)。羅非魚黏液細胞以成熟期的杯狀細胞為主，少量為囊狀細胞和梨狀細胞。杯狀細胞散在分布于柱狀細胞之間，呈高腳杯狀，其頂部胞質為大量糖原顆粒擁塞而膨隆，底部纖細，有小而深染的不規(guī)則核與少量嗜堿性胞質。杯狀細胞排列緊密，靠近絨毛頂端的杯狀細胞呈散在分布，不同的腸段杯狀細胞的數(shù)量有所不同。(見圖版6～10)

2.2.2 羅非魚腸道內黏液細胞的數(shù)量變化

由表3可以看出，各試驗組羅非魚腸道內黏液細胞數(shù)量均比對照組有所增加，且隨添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，前腸和中腸內黏液細胞數(shù)量:與對照組相比，1 000和1 500 mg/kg組顯著增加(P＜0.05)，500和2 000 mg/kg組無顯著變化(P＞0.05);后腸內黏液細胞數(shù)量:1 000和1 500 mg/kg組比對照組分別增加了 30.82%和47.17%，差異極顯著(P＜0.01)，2 000 mg/kg組比對照組增加了 23.90%，差異顯著(P＜0.05)，500 mg/kg組比對照組只增加了5.66%，差異不顯著(P＞0.05)。此外，在同一組的不同腸段中，羅非魚腸道內黏液細胞的數(shù)量順序為中腸＞后腸＞前腸。

表3 羅非魚腸道內黏液細胞數(shù)量變化Table 3 Quantity changes of mucous cells in intestinal of tilapia (個)

2.3 黃芪多糖對羅非魚腸道上皮內淋巴細胞分布及數(shù)量的影響

2.3.1 羅非魚腸道上皮內淋巴細胞的分布情況

羅非魚腸道組織經HE染色后，顯微鏡下觀察上皮內淋巴細胞為散在分布于腸絨毛上皮細胞內一群特殊淋巴細胞，多數(shù)位于上皮細胞基膜附近，少量見于上皮游離面。胞核大而圓，深染，胞漿少，固有層亦有淋巴細胞分布。不同的腸段和不同的試驗組，數(shù)量有差異，但形態(tài)差異不明顯。(見圖版1～5)

2.3.2 羅非魚腸道上皮內淋巴細胞的數(shù)量變化

由表4可以看出，各試驗組羅非魚腸道上皮內淋巴細胞數(shù)量均多于對照組，且隨添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，前腸上皮內淋巴細胞數(shù)量:各試驗組雖比對照組有所增加但差異均不顯著(P＞0.05);中腸上皮內淋巴細胞數(shù)量:1 000和1 500 mg/kg組比對照組分別增加了10.55%和13.17%，差異極顯著(P＜0.01)，2 000 mg/kg組比對照組增加了 8.72%，差異顯著(P＜0.05)，500 mg/kg組比對照組只增加了3.67%，差異不顯著(P＞0.05);后腸上皮內淋巴細胞數(shù)量:1 000 mg/kg組比對照組增加了5.52%，差異顯著(P＜0.05)，1 500 mg/kg組比對照組增加了10.67%，差異極顯著(P＜0.01)，其余組與對照組差異不顯著(P＞0.05)。此外，同一組不同腸段上皮內淋巴細胞數(shù)量中腸最多，后腸次之，前腸最少。

表4 羅非魚腸道上皮內淋巴細胞數(shù)量變化Table 4 Quantity changes of lymphocyte in intestinal epithelial of tilapia (個)

3 討 論

腸道是機體消化、吸收營養(yǎng)物質的重要場所，而腸絨毛作為小腸的重要組成部分，不但在吸收營養(yǎng)物質上至關重要，而且其強有力的、有規(guī)律的擺動也有助于排斥有害菌群的定植，同時，絨毛形態(tài)的變化也直接影響絨毛的表面積，進而影響機體吸收營養(yǎng)物質的能力[7]。Caspary等[8]報道指出腸絨毛長度增加后會使小腸接觸營養(yǎng)物質的面積增大，從而增強小腸對營養(yǎng)物質的吸收，所以腸絨毛的形態(tài)直接和機體的生長發(fā)育有關。隱窩深度反映了隱窩細胞的增殖率和成熟度。隱窩細胞從底部向絨毛上部遷移，在遷移過程中，細胞逐漸分化，形成具有吸收能力的柱狀細胞，腸絨毛高度與細胞數(shù)量呈顯著相關。絨毛短時，成熟的絨毛細胞減少，對養(yǎng)分的吸收能力低。而隱窩深度反映了細胞生成率，不斷有細胞從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細胞，以補充絨毛上皮的正常脫落。如果此過程減慢，則基部的細胞生成率降低，使隱窩變淺。而絨毛長度/隱窩深度比值(V/C值)綜合反映小腸的功能狀況，比值下降，表示黏膜受損，消化吸收功能降低，動物生長發(fā)育受阻[9-10]。本試驗研究結果表明，添加不同水平黃芪多糖的試驗組腸絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度相比于對照組都有一定程度的增加，其中以添加量為1 000和1 500mg/kg的2個試驗組增加效果較好，從而得出在飼料中添加黃芪多糖可以在一定程度上增加小腸絨毛的表面積，從而有助于羅非魚機體對營養(yǎng)物質的吸收。

對魚類黏液細胞的研究國內外已有大量的報道[11]，魚類黏液細胞廣泛分布于魚類體表、鰓和消化道等部位，分泌的黏液中含有多種有機物質，如粘多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各種水解性酶類，對魚類的許多生理功能有重要影響。黏液細胞所分泌的黏液中具有抵抗病原微生物入侵的非特異性的免疫化學反應物質，這些物質包括溶菌酶、轉移因子、C-反應蛋白、幾丁質、Ⅰ型干擾素及補體類物質等。它們有的可以殺滅細菌(如溶菌酶)，有的可抑制病毒的復制(如干擾素)，有的可作為調理素增加吞噬量(如C-反應蛋白)。此外，黏液中還具有同血液相似的血清學反應，免疫電泳分析也證明了黏液中含有免疫球蛋白，并且這種免疫球蛋白同血清免疫球蛋白具有一定的相似性。黏液細胞分泌的黏液物質中具有多種化學成分，因而黏液物質也具有不同的功能。杯狀細胞是一種典型的黏液細胞，主要分布于消化道和呼吸道等器官內的上皮中，杯狀細胞作為腸道黏膜免疫相關細胞的重要組成部分，構成腸道黏膜免疫系統(tǒng)的第一道防御屏障，在抗感染、調節(jié)上皮細胞的完整性和外來抗原的免疫應答方面起重要作用，其數(shù)量的變化可以在一定程度上反映消化道的局部免疫狀況[12]。本試驗結果表明，黃芪添加量為1 000和1 500 mg/kg的2個試驗組中腸黏液細胞數(shù)量比對照組分別增加了17.97%和21.48%，差異顯著(P＜0.05);黃芪添加量為1 000和1 500 mg/kg的2個試驗組后腸黏液細胞數(shù)量比對照組分別增加了30.82%和47.17%，差異極顯著(P＜0.01)。表明在飼料添加適量黃芪多糖在一定的程度能夠促進腸道黏液細胞的增殖。

作為一種特殊的淋巴細胞群體，腸上皮內淋巴細胞長期與腸道菌群、病原體等接觸，在黏膜抗感染免疫、調節(jié)上皮細胞的完整性和調節(jié)外來抗原的免疫應答方面起重要作用[13]。腸道相關淋巴組織分為組織性淋巴樣組織及散在于整個腸壁中的淋巴細胞。上皮內淋巴細胞是黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細胞，在腸道黏膜中起重要的免疫屏障作用[14]。腸上皮內淋巴細胞作為腸道相關淋巴組織中的一個特殊組分，是機體免疫系統(tǒng)中與外來抗原以及微生物最先接觸的免疫細胞，同時也是最先發(fā)生免疫反應的細胞。因此小腸上皮內淋巴細胞的數(shù)量可以反映小腸局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度[15]。另據(jù)研究表明，黃芪多糖可提高雛雞T淋巴細胞的轉化率，加速細胞免疫功能的發(fā)育與完善[16]，促進漿細胞增生和抗體合成[17]。本試驗結果表明，添加不同水平黃芪多糖的各試驗組腸絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度相比于對照組都有一定程度的增加，而且腸道黏液細胞和上皮內淋巴細胞的數(shù)量比對照組也有明顯的增多，其中以添加量為1 000和1500 mg/kg的2個試驗組效果最好。這表明飼料中添加黃芪多糖可以提高羅非魚機體的特異性免疫功能。此外本試驗還發(fā)現(xiàn)各組羅非魚不同腸段黏液細胞和上皮內淋巴細胞的數(shù)量分布也明顯不同，這和王子旭[18]對肉雞腸黏膜結構的研究結果相似。這可能與腸道不同部位所接觸病原微生物及食物抗原的種類和數(shù)量不同有關。

4 結 論

日糧中添加黃芪多糖可提高羅非魚腸絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度，增加腸道黏液細胞和上皮內淋巴細胞的數(shù)量，且以1 000和1 500 mg/kg添加量效果較好。

圖版Plate

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