王秀麗,高春芳,趙 光,盛新華

(解放軍第150中心醫(yī)院全軍肛腸外科研究所,河南洛陽(yáng) 471031)

利用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析喉癌患者血清蛋白質(zhì)譜變化

王秀麗,高春芳,趙 光,盛新華

(解放軍第150中心醫(yī)院全軍肛腸外科研究所,河南洛陽(yáng) 471031)

目的篩選喉癌特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物,建立用于喉癌診斷的分類樹(shù)模型。方法采集喉癌患者57例與正常人64例的血清,用表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜分別檢測(cè)其蛋白表達(dá)譜,用Biomarker Wizard軟件篩選出差異蛋白,再用Biomarker Patterns軟件建立喉癌診斷模型,另采集15例喉癌患者及20名正常人的血清對(duì)該模型進(jìn)行盲法驗(yàn)證。結(jié)果通過(guò)對(duì)喉癌患者術(shù)前血清與正常人血清蛋白質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)有24個(gè)蛋白的表達(dá)有明顯差異(P＜0.05),并建立了由質(zhì)荷比(M/Z)分別為4 206、6623、8 928和9 424 Da的4種蛋白質(zhì)組成的分類樹(shù)診斷模型,準(zhǔn)確率為95.0%(115/121),敏感性和特異性分別為94.7%(54/57)、95.3%(61/64)。盲法驗(yàn)證其敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。分析喉癌患者手術(shù)前后血清蛋白質(zhì)譜的變化,發(fā)現(xiàn)術(shù)前高表達(dá)的8種蛋白質(zhì)術(shù)后表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論喉癌血清蛋白質(zhì)譜診斷模型具有一定的優(yōu)越性,為喉癌的早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物的篩選提供了新途徑。

喉癌;SELDI-TOF-MS;生物學(xué)標(biāo)記;質(zhì)荷比(M/Z)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1437)

喉癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤之一,近年來(lái)其發(fā)病率有增高的趨勢(shì)。喉癌的定位診斷較容易,但在喉癌的早期診斷上仍缺乏有效的生物標(biāo)志物。近年來(lái)腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,尤其是表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(Surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)的出現(xiàn)為尋找腫瘤的生物標(biāo)志物提供了新的技術(shù)平臺(tái)[1]。本研究通過(guò)對(duì)喉癌患者與正常人血清差異蛋白的比較,建立了喉癌的血清蛋白質(zhì)譜診斷模型。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組喉癌病人57例(聲門癌22例、聲門上癌28例、聲門下癌7例),年齡40-72歲,中位年齡57.45歲。其中男性31例,女性 26例。血清標(biāo)本取自2007年2月-2008年12月在解放軍第150中心醫(yī)院住院的手術(shù)患者,均經(jīng)術(shù)后病理確診,均為不同分化階段的鱗狀細(xì)胞癌。正常對(duì)照組血清標(biāo)本64例,取自同期本院健康體檢人群。所有病人術(shù)前及術(shù)后15天清晨空腹無(wú)菌采靜脈血3 ml,1 000 rpm離心,收集上清分裝,-80℃保存。病人組與對(duì)照組在性別構(gòu)成和年齡上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并且三類標(biāo)本均經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查排除影響血清蛋白質(zhì)含量的其它相關(guān)疾病。

1.2 試劑與儀器

尿素、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)、三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)、3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)及羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。SELDI蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(PBSⅡ-C)及其配套的金屬親和表面(IMAC30)銅離子芯片均購(gòu)自美國(guó)Ciphergen公司。

1.3 方法

1.3.1 血清樣品準(zhǔn)備 4℃融解血清,1 000 rpm離心10 min;取20 μ l血清,置于1.5 ml離心管中 ;加40 μ l U9 緩沖液(含 9 mol/L尿素 、2%CHAPS 、50mmol/L Tris-HCl,pH9.0);4℃振蕩 30 min,使蛋白變性;取20 μ l變性后的樣品 ,加入 240 μ l IMAC 結(jié)合/洗脫緩沖液(含100 mmol/L磷酸鈉、500 mmol/L氯化鈉,pH7.0)中,使最后上樣的血清稀釋約40倍。

1.3.2 芯片預(yù)處理及與血清蛋白結(jié)合 芯片每孔加100 mmol/L硫酸銅溶液50 μ l,4℃下200 rpm振蕩5 min,去除硫酸銅溶液,用去離子水洗滌5次后甩干;每孔中加入100 mmol/L醋酸鈉(pH4.0)50 μ l,4℃振蕩5 min,去離子水洗滌5次;芯片每孔加入結(jié)合/洗脫緩沖液150 μ l,4℃振蕩 5 min后除去緩沖液,重復(fù)1次。將稀釋后的樣品取50 μ l加入芯池中,4℃孵育60 min后棄去液體;再用150 μ l結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗 2次;最后用 1 mmol/L HEPES(pH7.0)快速?zèng)_洗。取出芯片,自然風(fēng)干。在各孔芯池上加入飽和 SPA(取SPA1 mg溶于 15 μ l 50%ACN 、15 μ l 1%TFA 中)2 次 ,每次為 0.5 μ l。風(fēng)干后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 芯片檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理 用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀,設(shè)定儀器參數(shù)。檢測(cè)時(shí)設(shè)定SELDI-TOF-MS的激光強(qiáng)度為175,靈敏度為8,收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比(M/Z)范圍為2 000-20 000,收集位置 25-75。用 Ciphergen ProteinChip 3.2.0軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù),用Biomarker Wizard 3.2.0軟件對(duì)芯片檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)相對(duì)含量及蛋白質(zhì)M/Z數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.4 分類樹(shù)診斷模型的建立 用數(shù)據(jù)挖掘軟件Biomarker Patterns Software 5.0對(duì)所得數(shù)據(jù)分組及相關(guān)性進(jìn)行分析。建立用于喉癌與正常人的最優(yōu)分類樹(shù)診斷模型。觀察該模型的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 喉癌術(shù)前組與正常對(duì)照組血清樣品蛋白質(zhì)譜的比較

2.1.1 血清蛋白質(zhì)譜的比較 用Biomarker Wizard軟件對(duì)57例喉癌患者(術(shù)前)和64例正常人的血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析,喉癌組與對(duì)照組血清樣品中有半數(shù)蛋白峰的表達(dá)量都是基本相同的,但2組之間仍有24個(gè)蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有19個(gè)蛋白峰在喉癌組(術(shù)前)與對(duì)照組比較,差異顯著(P＜0.01)。在這19個(gè)蛋白中,喉癌組血清中高表達(dá)的蛋白占16個(gè);與正常對(duì)照組相比較,蛋白表達(dá)下調(diào)的有3個(gè),表1。

2.1.2 喉癌診斷模型的建立 用Biomarker Patterns軟件對(duì)檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,建立了M/Z分別為4 206、6 623、8 928和 9 424等4種蛋白組成的最優(yōu)分類樹(shù)診斷模型,圖1。該模型中節(jié)點(diǎn)1為根節(jié)點(diǎn),包括了所有用于建立模型的受檢樣本。各節(jié)點(diǎn)處的判別函數(shù)(各系數(shù)與括號(hào)內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量的積)分別為:在節(jié)點(diǎn) 1處如 -0.565(M4206)-0.825(M8928)≤-7.687,歸節(jié)點(diǎn) 2,否則為節(jié)點(diǎn)4。節(jié)點(diǎn)2處如 M9424≤2.252歸節(jié)點(diǎn)3,否則為終結(jié)點(diǎn)3。節(jié)點(diǎn)3處如 0.684(M4206)-0.729(M6623)≤2.438歸為終節(jié)點(diǎn)1,否則歸為終結(jié)點(diǎn)2。節(jié)點(diǎn)4處如M8928≤-0.075歸為終結(jié)點(diǎn)4,否則為節(jié)點(diǎn)5。節(jié)點(diǎn)5處如M4206≤-1.652歸為終結(jié)點(diǎn)5,否則為終結(jié)點(diǎn)6。終結(jié)點(diǎn)1、6被模型判別為正常人 ,終結(jié)點(diǎn) 2、3、4、5 為喉癌 。

2.1.3 分類樹(shù)模型對(duì)喉癌的診斷效率 分類樹(shù)模型在學(xué)習(xí)模式下對(duì)57例喉癌患者、64例正常人進(jìn)行分組,準(zhǔn)確率為96.7%(117/121),靈敏度和特異性分別為96.5%(55/57)、96.9%(62/64);在測(cè)試模式下對(duì)上述樣本進(jìn)行分組,其準(zhǔn)確率為94.2%(114/121),靈敏度和特異性分別為94.7%(54/57)、93.8%(60/64)。利用所建立的最優(yōu)分類樹(shù)診斷模型驗(yàn)證另外15份喉癌和20份正常對(duì)照樣品的血清蛋白圖譜,敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。

2.2 喉癌術(shù)前與術(shù)后血清蛋白質(zhì)譜的變化

在相同條件及參數(shù)下,應(yīng)用IMAC30蛋白芯片和Biomarker Wizard軟件對(duì)喉癌術(shù)后病人血清分析,并與術(shù)前組和正常對(duì)照組的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)前組19種高表達(dá)的蛋白在術(shù)后有14種蛋白表達(dá)量都有所下降,其中M/Z為6 960、4 206、8 518、13 876、6 960、9 424、14 052、3 910 等 8 種蛋白與正常對(duì)照組蛋白峰強(qiáng)度相當(dāng),無(wú)顯著差異,而與術(shù)前組比較具有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 喉癌組與對(duì)照組血清蛋白圖譜分類樹(shù)模型

表1 喉癌組和對(duì)照組血清質(zhì)譜中差異蛋白表達(dá)的比較

3 討論

喉癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的5%[2]。聲門型喉癌由于在病程早期就出現(xiàn)聲音嘶啞,因此可較早發(fā)現(xiàn)病變,聲門上癌或聲門下癌因早期癥狀不明顯,易延誤診斷,治療效果差,有時(shí)很難保留喉功能。因此,喉癌的早期診斷不僅可以徹底切除腫瘤,而且為保留或重建喉功能提供了機(jī)會(huì)。而從血清中尋找特異性生物標(biāo)記物用于喉癌的早期診斷是目前的研究熱點(diǎn)之一。血清中低分子量蛋白質(zhì)譜可反映出喉癌各個(gè)不同階段的病理變化,通過(guò)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行蛋白指紋圖譜分析,可能有助于喉癌的早期診斷。

SELDI-TOF-MS技術(shù)是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物,最先由Hutchens和Yip[3]提出,自Adam、Petricoin等[4,5]將其應(yīng)用于前列腺癌、卵巢癌的研究以來(lái),已被廣泛應(yīng)用于臨床常見(jiàn)惡性腫瘤[6]的研究。該技術(shù)在耳鼻咽喉頭頸外科方面也有相關(guān)的研究。Wadsworth等[7]應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)在99例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者、25例健康抽煙者及102例正常對(duì)照的血清中篩選差異表達(dá)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)33個(gè)蛋白質(zhì)峰與正常組有顯著差異。其中相對(duì)分子質(zhì)量為10 068的峰被鑒定為已知腫瘤標(biāo)記物MPS1。國(guó)內(nèi)肖雪媛等[8]對(duì)33例喉癌患者和31例正常人血清應(yīng)用蛋白芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析比較,喉癌患者中有16個(gè)差異蛋白(標(biāo)志分子),其中8個(gè)標(biāo)志分子在喉癌患者中高表達(dá),得出兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量8135和2053的蛋白質(zhì)用于建立喉癌診斷的分類模型。張秀強(qiáng)等[9]對(duì)46例喉癌患者血清進(jìn)行蛋白指紋圖譜與正常人比較,結(jié)果表明用該技術(shù)初步建立的區(qū)分喉癌與正常人血清蛋自差異表達(dá)模型可以區(qū)別喉癌和正常人,同時(shí)篩選出喉癌特異相對(duì)分子質(zhì)量4174、5192和4965的蛋白。

本研究采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)57例喉癌病人和64名正常人進(jìn)行了血清蛋白質(zhì)譜對(duì)比分析研究,發(fā)現(xiàn)喉癌病人與正常人血清中有24個(gè)蛋白質(zhì)峰具有顯著差別(P＜0.05)。將兩組血清蛋白質(zhì)譜建立數(shù)據(jù)庫(kù),利用Biomarker Patterns軟件建立了以M/Z分別為4 206、6 623、8 928和 9 424等4種蛋白組成的分類樹(shù)診斷模型,將喉癌病人與正常人正確分組,其正確分組率分別為94.7%(54/57)和95.3%(61/64)。用此模型盲法分析另外15例喉癌患者和20例健康人的血清蛋白質(zhì)譜,敏感性為86.7%(13/15),特異性為85.0%(17/20)。喉癌病人手術(shù)前后血清蛋白質(zhì)譜比較發(fā)現(xiàn),一些手術(shù)前高表達(dá)的蛋白質(zhì)在術(shù)后均明顯下降,其蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度與正常對(duì)照組相當(dāng)。

我們的研究結(jié)果表明,通過(guò)SELDI-TOF-MS技術(shù)所建立的喉癌的診斷模型具有重要的臨床意義,還可以利用該技術(shù)進(jìn)一步篩選預(yù)后標(biāo)志物。也要看到,SELDI-TOF-MS做為質(zhì)譜的一種,有其自身的劣勢(shì),如不適用于大分子量的蛋白質(zhì)的分析。同時(shí),由于血清蛋白質(zhì)具有巨大的動(dòng)態(tài)變化范圍(＞1010),而我們研究的樣本數(shù)量有限,對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)在評(píng)價(jià)喉癌治療效果中的應(yīng)用,還需要進(jìn)一步的深入。

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[9]張秀強(qiáng),陳 瑛,王巾幗,等.表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜血清蛋白指紋圖譜在喉癌診斷中的應(yīng)用[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20:842.

Analysis of serum protein spectra in patients with laryngeal carcinoma by SELDI-TOF-MS

WANGXiu-li,GAO Chun-fang,ZHAOGuang,et al.(Institute of Anal-colorectal surgery,150th Central Hospital of PLA,Luoyang471031,China)

ObjectiveTo explore the distinct expression of serum protein biomarkers of laryngeal carcinoma and create a decision classification tree model for diagnosing laryngeal carcinoma.MethodsSerum samples from 57 laryngeal carcinoma patients and 64 health people were collected and their serum protein fingerprinting were read by surface enhanced laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS).The Biomarker Wizard and Biomarker Patter software were used to screen and analyze the distinct proteins between the two groups.The best classification tree model was created for diagnosing laryngeal carcinoma.Then the model was blindly validated using another group of serum samples(15 from laryngeal carcinoma and 20 from healthy).ResultsTwenty-four distinct proteins of statistical significance were found between the sera from patients of laryngeal carcinoma pre-operation and healthy people(P＜0.05).The best decision classification tree model was successfully established,which included 4 kinds of proteinswith the mass-to-charge ratio 4206,6623,8 928 and 9 424Da.The accuracy of diagnosis was 95.0%(115/121),the sensitivity and specificity were 94.7%(54/57)and 95.3%(61/64),respectively.Blind test generated a sensitivity of 86.7%(13/15)and a specificity of 85.0%(17/20).Furthermore,the eight proteins over-expressed in serum from pre-operationwere obviously downregulated after operation.ConclusionThe diagnostic modelof serum fingerprinting is useful and offers a new approachfor early diagnosing laryngeal carcinoma and screening prognostic biomarkers.

laryngeal carcinoma;SELDI-TOF-MS;biological markers;mass-to-charge ratio(M/Z)

R739.65

A

1007-4287(2010)09-1437-04

book=1440,ebook=509

2009-11-20)