蔣 彧,葉蘭香,,何俊蓉*,王海娥,卓碧萍,劉 菲,熊學(xué)琴

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,四川 成都 610066;2.西南交通大學(xué),四川 成都 610031)

中國(guó)蘭花,亦稱國(guó)蘭,通常指蘭科蘭屬植物中一部分地生種類,包括春蘭(Cymbidium goeringii)、蕙蘭(C.faberi)、建蘭 (C.ensifolium)、墨蘭 (C.sinense)、寒蘭 (C.kanran)、蓮瓣蘭 (C.tortisepalum)和春劍(C.tongibracteatum)等 7個(gè)種[1]。洋蘭相對(duì)于中國(guó)蘭而言,興起于西方,主要指一些大花型附生種類,如卡特里亞蘭(Cattleya Ld l.)、大花蕙蘭(C.hybridum)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis Bl.)等[2]。與洋蘭花朵碩大、色彩艷麗相比,國(guó)蘭雖然花小、花少,但色彩清雅并具有獨(dú)特的香味,深受各國(guó)蘭友的喜愛(ài),具有廣闊的市場(chǎng)前景與價(jià)值。

近年來(lái),與洋蘭的工廠化、市場(chǎng)化程度相比,國(guó)蘭發(fā)展較為緩慢,其生產(chǎn)技術(shù)水平有待提高。因此,對(duì)國(guó)蘭的生物技術(shù)研究顯得格外重要和引人注目。本文對(duì)生物技術(shù)在國(guó)蘭中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,旨在對(duì)國(guó)蘭的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 組織培養(yǎng)技術(shù)

國(guó)蘭在自然狀態(tài)下繁殖困難,傳統(tǒng)的分株繁殖周期長(zhǎng)且繁殖率低。我國(guó)國(guó)蘭組培始于 20世紀(jì) 60年代后期,經(jīng)過(guò)多年的探索與研究,國(guó)蘭組培技術(shù)正在不斷地完善與創(chuàng)新。目前春蘭、建蘭、蕙蘭、墨蘭、寒蘭等國(guó)蘭組培已獲得成功。國(guó)蘭組織培養(yǎng)主要從兩方面進(jìn)行,即通過(guò)種子非共生萌發(fā)及莖尖、側(cè)芽和花芽等外植體培養(yǎng)[3]。

1.1 種子非共生萌發(fā)

蘭花種子體小量多,且不具備發(fā)育完整的胚,自然條件下很難萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn),在自然條件下蘭花種子需要真菌感染才能萌發(fā),將蘭花種子通過(guò)無(wú)菌進(jìn)行萌發(fā)的方式,為非共生萌發(fā)法[4]。Bernard利用眉蘭屬 Ophrys L.的塊莖配制培養(yǎng)基,成功獲得卡德麗亞蘭與蕾麗亞蘭雜交種子萌發(fā)苗,開(kāi)創(chuàng)了非共生萌發(fā)的先例[5]。隨著蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,多利用非共生萌發(fā)來(lái)進(jìn)行國(guó)蘭的培育。董芳等研究表明,在培養(yǎng)基中添加真菌誘導(dǎo)子可促進(jìn)春蘭組培物生長(zhǎng)量的增加及不定芽的分化[6]。黃磊等用春蘭和大花蕙蘭的雜交種子,經(jīng)非共生萌發(fā)得到了無(wú)菌試管苗[7]。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí),在國(guó)蘭種子的非共生萌發(fā)中,播種前對(duì)種子進(jìn)行適當(dāng)處理可以提高種子的萌發(fā)率。李麗等發(fā)現(xiàn),改良的 1/2MS基本培養(yǎng)基有利于春蘭種子的萌發(fā);激素對(duì)其影響差異不明顯;用10%NaClO(5%活性氯)溶液預(yù)處理 20 min～30 min,對(duì)種子萌發(fā)作用明顯[8]。

1.2 外植體培養(yǎng)

春蘭、墨蘭、建蘭均可用莖尖誘導(dǎo)出大量的類原球莖,類原球莖發(fā)育成根狀莖后進(jìn)一步長(zhǎng)成幼苗[9,10]。在墨蘭中有報(bào)道采用花芽等為外植體,但花芽誘導(dǎo)困難。葉片是比較理想的外植體材料,其中以試管苗的幼葉作為外植體培養(yǎng)較好。陳麗等從幼葉的葉尖表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞直接培養(yǎng)出體細(xì)胞胚,但在 30 d之內(nèi)無(wú)愈傷組織產(chǎn)生,在經(jīng)過(guò)下一級(jí)的培養(yǎng)后分化出幼苗[11]。根作為外植體大多采用根尖為材料,相繼在不同蘭花中獲得成功[12]。另外,還有用花梗作為外植體,但多用于洋蘭,國(guó)蘭中很少使用。王求清等用春蘭成年植株的根狀莖成功誘導(dǎo)出完整植株[12]。培養(yǎng)基的選擇,激素等添加物和外界條件尤為重要。在原球莖的誘導(dǎo)階段,加生長(zhǎng)素如 NAA和細(xì)胞分裂素對(duì)原球莖的誘導(dǎo)有利,加細(xì)胞分裂素對(duì)原球莖的分化有促進(jìn)作用;生根誘導(dǎo)時(shí)只需生長(zhǎng)素即可[13]。呂永杰等認(rèn)為,在蘭花的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中,利用半同體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)進(jìn)行原球莖增殖,利用同體培養(yǎng)分化和生根,可增加繁殖系數(shù),降低污染,減少成本,有利于大規(guī)模生產(chǎn)[14]。

2 分子標(biāo)記技術(shù)

由于分子標(biāo)記與傳統(tǒng)應(yīng)用的常規(guī)遺傳標(biāo)記相比具有諸多優(yōu)點(diǎn),部分標(biāo)記在蘭花遺傳育種中已得到廣泛應(yīng)用。現(xiàn)將分子標(biāo)記在國(guó)蘭育種中的應(yīng)用情況概述如下:

2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜的構(gòu)建是在分子水平進(jìn)行育種的依據(jù)。由于蘭科植物變異很大,中間類型多,種的界限不清楚,構(gòu)建蘭科植物的遺傳圖譜,可進(jìn)一步應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位、植物基因組作圖等。謝偉等利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA技術(shù)(RAPD)對(duì)蘭屬的 3個(gè)品種春蘭、春劍、惠蘭進(jìn)行了分析與研究,建立了它們之間的 DNA指紋圖譜,找到了參試樣品的特征譜帶,并探討它們之間的親緣關(guān)系[15]。

2.2 遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系

遺傳多樣性是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果,這對(duì)人工培育新型蘭花品種,提高蘭花質(zhì)量等工作指明了一個(gè)方向。其中,RAPD技術(shù)多用于評(píng)價(jià)和比較種內(nèi)、種間遺傳變異。謝偉等利用 RAPD技術(shù)對(duì)蘭屬 7個(gè)種的 9個(gè)品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析。選擇 6個(gè)引物檢測(cè) 64個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性,結(jié)果有 61個(gè)位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn),占總位點(diǎn)數(shù)的 95.3%;而聚類分析則表明其親緣關(guān)系與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致[16]。

2.3 品種圖譜構(gòu)建及雜種純度鑒定

蘭花品種繁多,還有大量的人工培育的中間種和變異植株。因此,可以根據(jù)分子標(biāo)記的品種圖譜構(gòu)建來(lái)進(jìn)行鑒定和分析。胡薇等應(yīng)用 RAPD標(biāo)記對(duì)建蘭 38個(gè)品種的分析表明,支持將建蘭分為彩心和素心兩個(gè)變種,且素心由彩心變異而來(lái)。另外,研究發(fā)現(xiàn)一些品種的特異標(biāo)記,如引物 S38-800 bp位點(diǎn)缺失是“馬耳四季”的特異標(biāo)記[17]。

2.4 分子標(biāo)記輔助育種選擇

變異、雜交和環(huán)境等結(jié)果使得蘭花在育種表型選擇時(shí),具有不確定性。利用分子標(biāo)記輔助育種選擇,可實(shí)現(xiàn)目的基因的選擇、轉(zhuǎn)移和累積以減短育種周期。其前提則是需要足夠的可行的識(shí)別位點(diǎn),且與標(biāo)記位點(diǎn)連鎖緊密。目前,蘭花是利用分子標(biāo)記輔助育種相對(duì)比較多的一種。

3 基因工程技術(shù)

外源基因?qū)敕ǜ牧继m花品種在許多洋蘭上已經(jīng)獲得成功,但在國(guó)蘭品種改良上,還少見(jiàn)報(bào)道,國(guó)蘭植物轉(zhuǎn)基因研究發(fā)展較為緩慢。國(guó)蘭的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立[18],但幾乎所有研究的轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低,一是蘭科植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌不敏感,缺乏合適的載體,二是國(guó)蘭再生體系建立的難度較大,目前幾乎沒(méi)有從國(guó)蘭脫分化再生植株的報(bào)道,即便有愈傷組織的產(chǎn)生,增殖率也很低,繼代培養(yǎng)后趨于壞死[19]?？追昌埑醪浇⒘艘惶走m合于春蘭的遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化材料通過(guò)了染色和檢測(cè),說(shuō)明基因已經(jīng)整合到春蘭的基因組中[20]。YangHH等成功地克隆了惠蘭花葉病毒外殼蛋白基因,用電子槍轟擊法將這一基因?qū)胩m花的原球莖和愈傷組織,得到了較高的轉(zhuǎn)化表達(dá)[21]。

4 前景與展望

隨著我國(guó)生物技術(shù)的發(fā)展,國(guó)蘭生產(chǎn)的前景將更為廣闊。組織培養(yǎng)是蘭花繁殖培育、工廠化生產(chǎn)的重要手段,但目前國(guó)蘭的組培相對(duì)于洋蘭還有很多技術(shù)急需改進(jìn)和發(fā)展,如國(guó)蘭的試管苗移栽后生長(zhǎng)緩慢和開(kāi)花遲的問(wèn)題以及蘭花共生菌根及其應(yīng)用問(wèn)題。建立和利用蘭花分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)國(guó)蘭進(jìn)行分類鑒定,研究其遺傳多樣性,弄清其品種間的親緣關(guān)系,為蘭花雜交、誘變和基因工程育種提供早期的輔助選擇指標(biāo)。同時(shí)也可采用基因工程技術(shù)創(chuàng)建符合大眾審美觀的轉(zhuǎn)基因蘭花。例如,可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將控制熱帶蘭花色的基因?qū)雵?guó)蘭中,形成兼有花色花香的新種類。也可以將螢火蟲(chóng)的熒光基因與 ATP水解酶基因一起轉(zhuǎn)化國(guó)蘭,并與化學(xué)調(diào)控技術(shù)相結(jié)合使國(guó)蘭接受自然燈光后在黑暗條件下閃閃發(fā)光,而成為“夜光國(guó)蘭”。另外國(guó)外對(duì)一些熱帶蘭品種進(jìn)行染色體加倍處理,使之成為多倍體,顯著地提高了其觀賞價(jià)值和商品價(jià)值。中國(guó)蘭花為二倍體植物,經(jīng)染色體加倍后,也將會(huì)有奇花異卉產(chǎn)生?？傊?用現(xiàn)代生物技術(shù)手段來(lái)武裝我國(guó)尚且落后的國(guó)蘭生產(chǎn)十分必要,是我國(guó)蘭花生產(chǎn)在世界花卉市場(chǎng)上占有一席之地的重要保證。

[1] 陳心啟,吉占和.國(guó)蘭、洋蘭三百問(wèn)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1996:108～109.

[2] 趙九洲.洋蘭生物技術(shù)研究及其應(yīng)用[J].北方園藝,2005,(4):77～78.

[3] 丁燕芬,王巖,龍春林.中國(guó)蘭花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,(8):2247～2248.

[4] BEMARD N.Sur la gem ination du neottia nidus-avis compt[J].Rend Acad＆Sci Paris,1899,(128):1253～1255.

[5] Bernard N.Levolution dans la symbiose les orchidèes et leurs champignons commensaux[J].Ann SciNat Bot Ser,1909,(9):1～196.

[6] 董芳,趙建娜,劉紅霞.真菌誘導(dǎo)子對(duì)春蘭組培物生長(zhǎng)的影響[J].北方園藝,2008,(5):194～196.

[7] 黃磊,賀筱蓉,鄭立明.促進(jìn)蘭花組培苗生長(zhǎng)的墨蘭菌根真菌研究初報(bào)[J].2004,25(1):36～38.

[8] 李麗,羅君琴,王海琴.春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J].福建熱作科技,2007,(3):13～14.

[9] 孫志棟,陳惠云,葛紅.中國(guó)春蘭組織培養(yǎng)初探[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,(1):20.

[10] 姜玲,張明濤,陳澤雄.墨蘭組織培養(yǎng)結(jié)合化學(xué)處理脫除建蘭花葉病毒(CymMv)的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2005,(6):1056～1060.

[11] 陳麗,潘瑞熾,陳汝民.墨蘭原球莖生長(zhǎng)的研究[J].熱帶亞熱植物學(xué)報(bào),1999,(1):59～64.

[12] 王求清,余通平.春蘭根狀莖離體培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào),2005,(32):706～707.

[13] 段金玉,謝亞紅.在無(wú)菌條件下激素和種了處理對(duì)蘭屬十種植物種子萌發(fā)的影響[J].云南植物研究,1982,(2):197～201.

[14] 呂永杰,李仕貴,周曉禾.觀賞蘭科植物組培快繁及遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2003,(10):42～46.

[15] 謝偉,樂(lè)超銀,郭政宏.蘭花基因組 DNA多態(tài)性 RAPD分析[J].湖業(yè)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(1):24～26.

[16] 謝偉,樂(lè)超銀,林直.蘭屬品種的 RAPD鑒定和親緣關(guān)系分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,(4):369～373.

[17] 潘曉華.建蘭 38個(gè)品種的 RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào),2008,(2):289～294.

[18] Yang J,Lee H,Shin DH,et al.Genetic transformation of Cymbidium orchid by partical bombardment[J].Plant Cell Reports,1999,(18):978～984.

[19] Roy J,Banerjee N.Induction of callusand plant regeneration from shoot-tip explantsof Dendrobium fimbriatum Lindl.Var.oculatum Hk.F[J].Scientia Horticulturae,2003,(97)333～340.

[20] 孔凡龍.春蘭的組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究[D].浙江大學(xué),2008.

[21] Yang Hun-cheng,Chua NH.蘭花色素生物合成基因的分離與特征[C].第 13屆世界蘭花大會(huì)論文集,1990.