楊世紅 李美玉 劉迎春 辛守帥

（①山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100 ②青島農(nóng)業(yè)大學）

現(xiàn)代生物技術(shù)主要包括人工授精、胚胎工程技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、動物克隆技術(shù)、性別控制技術(shù)、體外受精技術(shù)和分子生物技術(shù)等。80年代以來，生物技術(shù)領域的發(fā)展非常迅速，無論在基礎研究還是在開發(fā)應用方面，都取得了令世人矚目的成就。尤其在動物遺傳育種與繁殖方面，顯示出越來越強大的生命力，逐漸成為動物育種和繁殖的趨勢和主流。在家兔生產(chǎn)中，各種生物技術(shù)也被育種學家充分利用，對家兔品種的培育產(chǎn)生了重要影響?，F(xiàn)將幾種生物技術(shù)在家兔上的應用作一綜述。

1 人工授精與胚胎移植技術(shù)

人工授精就是用器械采集公畜的精液，經(jīng)過品質(zhì)鑒定后，再借助器械將精液輸入到發(fā)情母畜生殖道內(nèi)，使其受胎。人工授精在動物育種與繁殖中的應用已有70多年的歷史，它不僅改變了家畜交配過程，更重要的是能充分發(fā)揮優(yōu)良種公畜的作用，減少公畜的飼養(yǎng)量，大大提高了公畜的配種效能，防止了生殖道傳染疾病的傳播，提高了母畜的受胎率，改良了家畜的群體。因此是家畜育種、繁殖生物技術(shù)中應用最為廣泛的一項技術(shù)。但人工授精技術(shù)在家兔育種中的應用僅有20多年的歷史[1]，盡管歷史較短，但目前一些大型集約化養(yǎng)兔場或養(yǎng)兔比較集中的地區(qū)，為提高家兔的繁殖力，大都采用人工授精的方法，且成果顯著。

胚胎移植也稱受精卵移植或簡稱卵移植，就是將1頭良種動物配種后的早期胚胎取出，移植到另1頭同種的生理狀態(tài)相同的動物體生殖器官內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體。1890年英國劍橋大學的Walfer Heape首次將安哥拉家兔的受精卵移植到比利時兔的輸卵管內(nèi)，并成功獲得2只仔兔。此后，其它胚胎移植的動物如牛、羊等相繼問世，使得胚胎移植技術(shù)跨入了具有生產(chǎn)意義的畜牧業(yè)領域，為畜禽良種的繁殖推廣奠定了基礎。目前,家兔胚胎移植技術(shù)在我國已有成功的報道。

2 動物克隆技術(shù)

所謂克隆就是無性繁殖，即利用卵母細胞和另一動物體細胞轉(zhuǎn)核法，不經(jīng)過受精過程而獲得新個體的方法。1997年，英國科學家Wilmut領導的研究小組通過克隆的方式獲得了世界上第一個克隆羊---多莉，多莉的誕生，標志著這一技術(shù)的重大突破?？寺⊙虻恼Q生，從理論上充分證明了已分化的動物細胞仍具有全能性，在適當?shù)臈l件下，通過基因重組可以發(fā)育成新的個體。這對于發(fā)育生物學、遺傳學理論的深入發(fā)展產(chǎn)生了重大影響。

繼克隆羊多莉之后，克隆動物牛、羊、鼠等在世界上多個國家先后問世。家兔因其繁殖力強、妊娠期短、很快便可獲得研究結(jié)果，因而成為核移植研究的理想模型動物。兔的胚胎細胞核移植研究起步較早，Stice 和Robl 早在1988年就已獲得世界首批6只基因型完全相同的核移植兔[2]。隨后，Collas和 Robl 改進了核移植技術(shù)，獲得了10%的移植產(chǎn)仔率(230枚重組胚移植后，23 只仔兔出生)[3]。常萬存等以家兔16～32細胞期胚胎卵裂球為核供體，顯微注射到去核卵母細胞中，獲得2只克隆仔兔[4]。雖然兔胚胎細胞克隆兔早已出生，但仍然存在移植妊娠率和產(chǎn)仔率低等問題。特別是關于受體卵母細胞胞質(zhì)狀態(tài)、融合參數(shù)以及重組胚胎的培養(yǎng)方法對核移植胚胎后續(xù)發(fā)育的影響報道不一[5-7]?；谏鲜鰡栴}，崔奎青等對影響兔胚胎細胞核移植的相關因素進行了系統(tǒng)的研究，為提高核移植胚胎發(fā)育能力提供了依據(jù)[8]。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導入另一個體的基因組中，產(chǎn)生具有新的性狀或功能的個體。自80年代初，美國科學家首次用顯微注射法將DNA序列導入原核培育出轉(zhuǎn)基因動物以來，這項技術(shù)引起了眾多學者和生物工程公司的極大興趣。近年來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，先后培育出轉(zhuǎn)基因的鼠、羊、牛、豬、雞、兔、魚等，為動物基因工程開辟了新的途徑。

目前在轉(zhuǎn)入基因的選擇上主要有以下幾類[9]：（1）編碼蛋白基因：這類基因主要參與調(diào)節(jié)機體組織的生長發(fā)育，如生長激素基因等；（2）抗性基因；（3）經(jīng)濟性狀主效基因，如豬和綿羊的高繁殖力基因和肉牛的“雙肌”基因等，這些基因與動物的生產(chǎn)力密切相關；（4）治療某些疾病所需的蛋白質(zhì)基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)廣泛應用于基因治療、基因敲除、改良家畜、提高抗病力、用作生物反應器生產(chǎn)藥品等。

近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家兔中取得了重大成果。潘慶杰等利用精子載體法建立了乳鐵蛋白的乳腺生物反應器轉(zhuǎn)基因家兔模型，為利用精子介導制備轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應器奠定了基礎[10]。李蘭等采用直接注射法，將脂質(zhì)體或DMSO包裹的含山羊β-casein基因調(diào)控序列調(diào)控ht-pam的乳腺表達的載體注入成年公兔睪丸中，一個月后分別與正常成年母兔交配，共產(chǎn)生仔兔182只，經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因陽性率為48.2%，該方法為轉(zhuǎn)基因動物的研究提供了一種簡捷有效的新途徑[11]。中科院上海細胞研究所的研究人員構(gòu)建了含乙肝表面抗原的兩種載體PMT’SA和pHBV3.0，通過顯微注射導入兔受精卵雄性原核，獲得了轉(zhuǎn)基因當代兔(F1代)。中科院發(fā)育研究所陳清軒用顯微注射法將SMT’ PGH基因?qū)胪门咴耍M行不同培養(yǎng)基對早期轉(zhuǎn)基因胚的影響和外源基因在早期胚中的滯留情況的研究。謝慶閣等構(gòu)建了抗豬瘟Ribozyme基因表達載體，并將其導入家兔受精卵，探索對豬瘟病毒的抗性研究。王敏華報道用顯微注射法轉(zhuǎn)移抗豬瘟病毒核酶基因，獲得了轉(zhuǎn)基因兔，其抗病力明顯提高[12]。

總之，轉(zhuǎn)基因技術(shù)運用于動物遺傳育種中，不僅可以加快性狀的遺傳改良進程，提高選擇效率，還可以提高動物的抗病力。轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)學領域中的應用更為廣泛，如藥物的開發(fā)、器官移植等，治療人類多種疾病。因此轉(zhuǎn)基因動物育種技術(shù)的進步，不僅促進畜牧生產(chǎn)的發(fā)展，還可拓展家畜新的用途，為畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供技術(shù)力量。

4 分子遺傳標記技術(shù)

20世紀80年代以來，隨著分子生物學、分子遺傳學的迅速發(fā)展，對基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究不斷走向深入，一種新的標記方法—分子遺傳標記應運而生。分子遺傳標記是在分子水平上研究DNA的多態(tài)性，從而檢測生物個體、品種間的差異。

分子遺傳標記的方法有十多種，但從總體上分為四大類，第一類是以分子雜交為基礎的標記技術(shù)，如RFLP；第二類是以PCR為基礎的標記技術(shù)，如RAPD、SSCP、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等；第三類是基于 PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標記，如AFLP；第四類為單核苷酸多態(tài)性的DNA標記。

遺傳標記的分子生物技術(shù)主要應用于以下方面：（1）構(gòu)建分子遺傳圖普，進行基因定位；（2）主要經(jīng)濟性狀主基因或有害基因的檢測、分離和克?。唬?）研究動物的起源進化、品種資源的保存、分析物種間的親緣關系、雜交親本的選擇和雜種優(yōu)勢的預測等；（4）利用DNA標記進行輔助選擇；（5）突變分析；（6）證身和父系測驗等。

目前，分子遺傳標記在豬、牛、羊、家禽等動物育種中的研究較為廣泛，但在家兔生產(chǎn)中研究的為數(shù)不多。楊麗萍等[13]應用RAPD對新西蘭白兔、加利福尼亞兔、布列塔尼亞配套系(ELCO)進行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)家兔品種內(nèi)的遺傳相似度大于品種間的遺傳相似度，且ELCO的D系與新西蘭白兔、加利福尼亞兔的親緣關系較近，聚為一個類群；ELCO的A系與B系親緣關系較近，聚為一個類群。韓春梅、張嘉保等用13個微衛(wèi)星位點對吉戎兔進行了親子鑒定[14]。齊冰，何新等[15]對家兔早期胚胎發(fā)育的相關基因IFRG進行了克隆和表達，經(jīng)誘導培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)在41KDa處有特異性表達蛋白，回收融合蛋白作為抗原免疫小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，該融合蛋白具有生物免疫活性。

5 生物技術(shù)在養(yǎng)兔業(yè)中存在的問題和發(fā)展前景

目前，生物技術(shù)在家兔育種上的應用還處于初始階段，在技術(shù)和方法上尚存在一些缺限需要進一步完善，但這些先進的技術(shù)已經(jīng)展示了美好的應用前景?？梢詧孕?，隨著生物技術(shù)研究的不斷深入，其在家兔生產(chǎn)上的應用會越來越廣泛，并將對今后養(yǎng)兔業(yè)的生產(chǎn)帶來巨大的效益。因而，要注重動物生物技術(shù)的研究與開發(fā)，利用我國資源的優(yōu)勢，在加強基礎研究的同時，使一批業(yè)已成熟的高新技術(shù)走向市場，走向農(nóng)村，服務于優(yōu)質(zhì)高效的現(xiàn)代化畜牧業(yè)。在不久的將來，動物生物技術(shù)將在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中大放異彩。

總之，分子生物技術(shù)的發(fā)展、現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合，使動物分子育種及胚胎工程育種成為可能，從而大大縮短育種的世代間隔，加速育種的進程。同時也進一步提高了動物經(jīng)濟性狀的生產(chǎn)性能，促進了畜牧業(yè)的發(fā)展。在家兔育種及生產(chǎn)中，還有待于進一步充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)，為養(yǎng)兔業(yè)提供更多更好的高產(chǎn)新品種。

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