田從魁,崔承彬,李長偉

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所,北京100850)

細胞壁通透性調(diào)控在真菌菌株選育中的應用*

田從魁,崔承彬**,李長偉

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所,北京100850)

真菌細胞壁作為小分子進出細胞的第一道屏障有其特殊性。通過物理或化學方法使細胞壁部分或完全喪失生理功能來調(diào)控其通透性并結(jié)合現(xiàn)有的生物技術(shù)進行真菌菌株選育是1種新的菌株選育思路。本文主要綜述調(diào)控真菌細胞壁的方法并結(jié)合已有研究結(jié)果討論其在真菌菌株選育中的應用。

微生物;真菌;細胞壁;菌株選育

微生物次級代謝產(chǎn)物具有來源豐富、結(jié)構(gòu)新穎等特點,是新藥先導化合物的重要來源之一。然而,野生菌株往往因產(chǎn)能低或其次級代謝產(chǎn)物中無相應目標產(chǎn)物而不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)或新藥篩選的需要。因此,菌株選育作為整個微生物藥物研發(fā)的基礎,處于十分重要的地位。目前,菌株選育的方法主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、基因工程等,通常由菌種變異、突變株篩選、表達突變株特性3個環(huán)節(jié)組成。長期以來,真菌菌株選育受到很多因素的制約,其中真菌細胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性是一個重要因素。近年來,真菌細胞壁已引起了科學家的極大興趣與重視[1-3]。迄今,國內(nèi)外已開展了許多以真菌細胞壁為對象的課題研究,并取得了眾多突破性進展。真菌細胞壁是細胞的外部屏障,如對其進行調(diào)控使之部分或完全喪失生理功能,小分子物質(zhì)的滲透障礙將被部分或完全解除,從而達到影響外界物質(zhì)進入細胞,同時也會增加細胞對外界環(huán)境的敏感性。傳統(tǒng)的菌株選育技術(shù)應用于真菌往往由于細胞壁的存在而降低了其選育效果。真菌的原生質(zhì)體即通過酶水解剝離其細胞壁后的原生質(zhì)膜包裹的原生質(zhì),迄今已有許多在原生質(zhì)體基礎上進行誘變育種[4-5]的研究報道,其誘變效率明顯改善。本課題組正在開展通過調(diào)控真菌細胞壁的通透性結(jié)合抗生素抗性篩選來活性化轉(zhuǎn)化無活性真菌野生菌株的研究[6-7],從目前已取得的研究進展結(jié)果看,細胞壁通透性的成功調(diào)控是實驗成功的關(guān)鍵。鑒于細胞壁與真菌菌株選育的關(guān)聯(lián),本文提出真菌細胞壁通透性調(diào)控與現(xiàn)有育種技術(shù)結(jié)合的新育種思路并對其應用前景進行展望。

1 真菌細胞壁的組成

真菌的細胞壁組成與原核微生物存在很大差異,因而具有與原核微生物細胞壁不同的生物學功能,例如作用于細菌細胞壁發(fā)揮抑菌作用的內(nèi)酰胺類抗生素對真菌就不能發(fā)揮抑菌作用。真菌細胞壁的主要成分為多糖,蛋白質(zhì)、類脂等,類群不同,細胞壁多糖類型也不同。真菌細胞壁多糖主要有幾丁質(zhì)(甲殼質(zhì))、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等[8]。絲狀真菌的細胞壁成分主要以幾丁質(zhì)和葡聚糖為主,但卵菌綱、子囊菌的部分種卻以纖維素為主,而酵母菌中則以葡聚糖和甘露聚糖為主要成分[9]。真菌細胞壁具有一定的機械強度和柔韌性,對細胞起保護作用。真菌細胞內(nèi)含有大量有機物和無機鹽,因而在細胞內(nèi)產(chǎn)生很大的滲透壓,細胞壁起著保護細胞膜不受滲透壓破壞的作用。同時因細胞壁具有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生分子篩作用[10]。

2 真菌細胞壁的通透性調(diào)控

微生物菌株選育主要依據(jù)突變株的菌落形態(tài)、生長速度、產(chǎn)生色素等方面的外觀變化,挑取與出發(fā)菌以及突變株之間外觀特征差異大的菌落進行分離純化,并經(jīng)發(fā)酵篩選獲取優(yōu)于出發(fā)菌的突變株。之所以能產(chǎn)生優(yōu)良突變株其根源在于其遺傳特性發(fā)生了改變。然而,能改變遺傳特性的各種因素在一定程度上均受到微生物自身結(jié)構(gòu)特征的制約。如真菌細胞壁的特殊結(jié)構(gòu)就防止了許多外部因素對真菌細胞的作用,從而直接影響育種效果。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和對真菌細胞結(jié)構(gòu)的深入研究,影響真菌細胞壁通透性的許多因素相繼被發(fā)現(xiàn),調(diào)控真菌細胞壁通透性的技術(shù)方法也顯露出在育種領(lǐng)域中的應用前景。

2.1 物理方法

物理方法對真菌細胞壁的調(diào)控主要靠機械方法或生物學效應使細胞壁出現(xiàn)一定程度損傷或破裂。

2.1.1 機械研磨 機械研磨法通常采用人工研磨的方式,將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起攪拌,使細胞獲得破碎。在提取真菌染色體DNA時首要考慮的是如何有效破壞真菌細胞壁,因此產(chǎn)生了一系列破壞真菌細胞壁的方法,如液氮、干冰、玻璃珠等機械研磨方法[11-12]。當采用機械研磨法時,研磨時間和強度等對細胞壁的損傷或破裂程度是需要重點考察的因素。

2.1.2 超聲波 超聲波具有熱、機械作用和空化效應等生物學效應。超聲波在液體中傳播時,能引起媒質(zhì)分子以其平衡位置為中心的振動,使分子間的平衡距離發(fā)生改變,當平衡距離增幅超過極限距離時,液體結(jié)構(gòu)的完整性就會受到破壞。該作用可能導致空泡周圍細胞的細胞壁和質(zhì)膜被擊穿或發(fā)生可逆的質(zhì)膜透性改變[13]。此外,低強度超聲波不僅可使細胞周圍形成微流,還可使細胞產(chǎn)生胞內(nèi)環(huán)流,從而提高了細胞膜和細胞壁的通透性。在細胞存活的前提下,超聲波對細胞通透性的提高是可逆的。因此,當利用超聲波改變細胞通透性時,需考察其強度和持續(xù)時間,以保證細胞通透性足以維持目的分子有效進入細胞。

2.1.3 微波 微波電磁場的場力影響細胞膜附近的離子分布,使細胞壁發(fā)生一定程度的損傷,影響細胞的功能。電磁場的場力還可使細胞分子產(chǎn)生強迫振動,從而引起膜結(jié)構(gòu)破壞[14],進而影響和改變細胞的通透性。微波的熱效應可導致細胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,使胞內(nèi)溫度迅速上升,細胞質(zhì)膨脹以及液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破,形成微小的孔洞,進一步加熱,導致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少,細胞收縮,表面出現(xiàn)裂縫。孔洞或裂紋的存在使胞內(nèi)外物質(zhì)易于進出細胞。進行微波處理時,主要通過改變微波強度和微波輻照時間來改變細胞壁的通透性。

2.1.4 其他物理方法 激光束[15]、離子束[16]等也能影響真菌細胞的細胞壁,使細胞壁的生理功能發(fā)生改變。

2.2 化學方法

化學方法主要利用各種化學物質(zhì),通過對細胞壁相關(guān)各種酶的特異性作用或通過一些機理尚不明確的作用來影響細胞壁結(jié)構(gòu),從而對真菌細胞壁進行調(diào)控。

2.2.1 作于細胞壁的藥物 作用于真菌細胞壁的藥物主要通過抑制葡聚糖合成酶或幾丁質(zhì)合成酶破壞細胞壁的完整性,進而導致細胞膜結(jié)構(gòu)破損。細胞壁膜是藥物到達胞內(nèi)作用靶位的必經(jīng)之路,藥物能夠改變膜的流動性,破壞膜上蛋白質(zhì)發(fā)揮正常功能所需條件,通過與膜外層蛋白非特異性結(jié)合,從而改變突觸膜對離子的通透性而引起的變化產(chǎn)生藥效[17-18]。作用于真菌細胞壁的藥物通過破壞細胞壁完整性,改變通透性,提高細胞對外界物質(zhì)的敏感程度。

2.2.2 有機溶劑 迄今,對有機溶劑影響細胞通透性機理的研究尚處探索階段。有機溶劑能改變真菌細胞壁的通透性,其自身對真菌細胞的影響也是需要考察的因素。有機溶劑如甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等能分解細胞壁中的類脂,使胞壁膜溶脹[19]。DM -SO是1種萬能溶劑,有良好的穿透性能,能夠增加細胞壁膜的通透性。Pottz等[20]實驗證明,用0.5%～5%的DM SO前處理鏈霉素和異煙肼可使結(jié)核菌對兩種藥物的耐受劑量由2 000μg降至2μg。Kamiya[21]等發(fā)現(xiàn),5%的DM SO能恢復或者增強抗生素抗性菌株對抗生素的敏感性,對某些菌無效的抗生素在DM -SO存在時也顯示出對這些菌的抑制作用,比如青霉素對大腸桿菌無效,但當在培養(yǎng)基中加入DM SO時,顯示出明顯的生長抑制效應。

2.2.3 其他化學物質(zhì) 羅曼等[22]發(fā)現(xiàn),檸檬醛能破壞黃曲霉菌絲體以及孢子的細胞壁和質(zhì)膜的結(jié)構(gòu),并改變其通透性,影響對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,從而抑制生長。戰(zhàn)廣琴等[23]證明香茅醛能破壞黑曲霉的細胞壁、質(zhì)膜,改變質(zhì)膜選擇通透性。常頌平等[24]證實了冰片可以作用于細胞壁,使其通透性增強,藥物進入細胞內(nèi),破壞線粒體,使細胞氧化磷酸化和細胞能量偶聯(lián)系統(tǒng)遭受破壞,能量產(chǎn)生減低,導致細胞漿內(nèi)出現(xiàn)電子空白區(qū)。

2.3 生物方法

生物方法對真菌細胞壁進行調(diào)控的簡便方法主要是借助細胞壁溶解酶,即胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。在真菌中,溶解酵母細胞壁的溶解酶主要為β-葡聚糖酶,而溶解霉菌細胞壁的溶解酶主要為幾丁質(zhì)酶[25]。作為工具酶,幾丁質(zhì)酶主要用于真菌細胞壁的降解和重組,但在大多數(shù)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的真菌中主要用于真菌細胞壁的成型過程。β-葡聚糖酶主要用于分解酵母細胞的細胞壁,還可以對幾丁質(zhì)酶降解真菌細胞壁起到顯著的協(xié)同作用[26]。用真菌細胞壁溶解酶調(diào)控細胞壁,主要靠酶催化細胞壁多糖水解,從而溶解細胞壁。該方法操作簡便,在細胞懸浮液中加入特定的酶即可,但采用復合酶或幾種酶的混合液,往往比單獨使用一種酶的破壁效果好[27]。如酵母多使用Zymolyase、蝸牛酶等,絲狀真菌多用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、D riselase、Lysing Enzyme等。使用酶法去除真菌細胞壁制備原生質(zhì)體的研究已十分深入,但利用酶法部分去除或抑制細胞壁生物功能來調(diào)控通透性,從而改善育種效果的研究并未見深入開展。

3 真菌菌株選育現(xiàn)狀

絲狀真菌Penicillium chrysogenum次級代謝產(chǎn)物青霉素的發(fā)現(xiàn)與后來從絲狀真菌Tolypocladium inf latum中獲得的選擇性免疫抑制劑環(huán)孢菌素(Cyclosporin)的成功開發(fā),成為了人類醫(yī)學史上里程碑式的發(fā)現(xiàn)。真菌長期以來一直受到極大的關(guān)注。許多有用的化合物或者重要先導化合物來源于真菌代謝產(chǎn)物,如煙曲霉素(Fumagillin)、梭鏈孢酸(Fusidic Acid)、干蠕孢菌素(Siccanin)、宛氏霉素(Variotin)、黃霉素(Xanthocillin)、洛伐它汀(Mevinolin)等。此外,如雷帕霉素(Rapamycin)、阿卡波糖(Acarbose)、他克莫司FK-506(Tacrolim us FK-506)等起初從放線菌發(fā)現(xiàn),但后來從真菌產(chǎn)物中也分離得到[28]。而如何獲得有用產(chǎn)物產(chǎn)生菌資源,對于微生物藥物篩選具有重要意義,因此,菌株的優(yōu)化一直以來備受重視。目前,真菌菌株選育主要使用各種物理或化學誘變劑誘導DNA突變,并經(jīng)活性篩選獲取目標菌株。雖然,目前應用的誘變方法缺乏特異性靶位,正向突變率低,工作量大,但是,因其使用范圍廣,無需菌株遺傳背景知識,以及具有可成功性等優(yōu)點,仍然為菌株選育有效可行的方法[29]。

隨著相關(guān)學科的交融與發(fā)展,基因重組技術(shù)、遺傳工程等技術(shù)也成功用于真菌菌株的選育。Cantwell等[30]將cefEh(編碼青霉素N擴環(huán)酶)和CepDh(編碼青霉素N差向異構(gòu)酶)成功導入青霉素產(chǎn)生菌中,并從其發(fā)酵液中分離得到了頭孢菌素的前體deacetoxycephalosporin C,從而構(gòu)建了1個新的頭孢菌素生合成途徑。Craw fo rd等[31]利用DNA重組技術(shù),改變產(chǎn)黃青霉的代謝途徑,發(fā)酵生產(chǎn)了半合成抗生素中間體7-ADCA。Berg[32]等完成了Penicillium chrysogenum的基因組測序并分析確定了許多影響青霉素產(chǎn)量的基因?；蛑亟M技術(shù)為菌株改造提供了更為廣闊的發(fā)展空間。目前在國內(nèi)也開展了許多利用基因工程改造真菌菌株的相關(guān)研究。王富強等[33]成功構(gòu)建了產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)基因載體p PIPKA,并建立了優(yōu)化工業(yè)菌株的高效轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化率高達18個轉(zhuǎn)化子/μg DNA。李兵等[34]將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)克隆至質(zhì)粒載體pM K4中,構(gòu)建了表達載體pM K4-LV,并用于轉(zhuǎn)化青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)黃青霉的原生質(zhì)體,獲得了轉(zhuǎn)化子,經(jīng)發(fā)酵vgb的表達使青霉素產(chǎn)量提高了9.68%。但是,運用現(xiàn)代生物技術(shù)進行的菌株選育往往局限于對遺傳背景研究比較透徹的菌株且對實驗人員的專業(yè)知識要求較高,因此實際應用受到制約。

4 細胞壁通透性調(diào)控在真菌菌株選育中的應用前景

破壞細胞壁的屏障作用,可直接引起細菌突變,進而影響和改變其代謝功能。迄今,細胞壁缺陷對原核微生物的影響已有廣泛深入的研究。細胞壁缺陷變異是細菌變異的一種特殊類型,細胞壁缺陷不但導致細菌的形態(tài)發(fā)生變化,也常常導致代謝、致病性、遺傳等多種特性發(fā)生改變。已有研究[35]證實,細胞壁缺陷造成淋病奈瑟菌的形態(tài)等生物學特性改變以及cppB基因丟失。陳燕萍[36]等通過研究細胞壁缺陷對傷寒沙門菌代謝特性的影響發(fā)現(xiàn),細胞壁缺陷細菌可致其形態(tài)和多種生理特性發(fā)生改變,而且細胞壁缺失的程度不同,可導致細胞壁缺陷細菌表現(xiàn)出不同的代謝特性。部分喪失細胞壁的缺陷細菌通?？杀Ａ襞c親代相同或相似的多種代謝活性,而完全缺失細胞壁的細胞壁缺陷細菌則完全喪失常規(guī)細菌學方法可檢測的親代細菌所具備的各種代謝活性。然而,真菌細胞壁缺損或缺失與其代謝相關(guān)性的研究尚未見文獻報道,可否通過造成細胞壁的人為缺損獲得次級代謝發(fā)生變化的真菌突變株,也是一個值得探索的課題。

真菌細胞壁相關(guān)研究已取得許多突破性進展,而真菌細胞壁相關(guān)藥物靶點的發(fā)現(xiàn)已極大地推動了抗真菌藥物的研究發(fā)展。然而,與真菌細胞壁有關(guān)的育種技術(shù)研究迄今仍然停留在針對原生質(zhì)體的水平上,如原生質(zhì)體融合、對原生質(zhì)的傳統(tǒng)物理化學誘變育種等。胡杰等[4]對米曲霉原生質(zhì)體進行紫外線-氯化鋰、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍復合誘變,篩選到8株高產(chǎn)中性蛋白酶的突變株,其中最高產(chǎn)酶活力達出發(fā)菌株的1.62倍。于長青等[5]采用紫外線誘變原生質(zhì)體的方法,獲得的高產(chǎn)菌株YZ-124所產(chǎn)花生四烯酸的產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了5.76倍,且遺傳性能穩(wěn)定。朱林東[37]等利用始旋鏈霉菌原生質(zhì)體,經(jīng)UV誘變結(jié)合自產(chǎn)普那霉素抗性篩選,獲得高產(chǎn)突變株,其普那霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高101.3%。

由于真菌細胞壁的特殊結(jié)構(gòu),許多傳統(tǒng)誘變策略或前沿生物技術(shù)在用于真菌選育時均受到不同程度限制。調(diào)控真菌細胞壁,使之部分或完全喪失生理功能,同時與現(xiàn)有的生物技術(shù)進行組合應用,有可能解決目前真菌育種中的很多難點問題。如核糖體工程抗生素抗性篩選育種技術(shù)已作為成熟的方法在放線菌等原核生物類群得到廣泛應用[38-39],但對真菌的相關(guān)研究卻未見報道。本課題組曾嘗試用常規(guī)的核糖體工程技術(shù)對無活性真菌野生株進行選育改造,但由于真菌細胞壁的屏障作用使抗生素無法到達作用部位,因而未獲成功。后經(jīng)實驗摸索,通過將真菌細胞壁通透性調(diào)控與核糖體工程技術(shù)以及人工誘變技術(shù)結(jié)合進行育種,獲得了成功。

通過調(diào)控細胞壁功能選育真菌目的菌株,屬新的菌株選育思路。本課題組在有關(guān)真菌藥源活性菌株資源開發(fā)相關(guān)研究中,通過調(diào)控細胞壁功能,用氨基糖苷類抗生素從無活性海洋真菌G59已成功轉(zhuǎn)化獲得了一系列抗性突變株,并經(jīng)抗腫瘤抗真菌活性篩選,獲取了相當數(shù)量的高活性突變株,而且還分離闡明了部分突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物[40-43]。相關(guān)研究進展結(jié)果已初步顯示出細胞壁通透性調(diào)控技術(shù)在真菌菌株選育中的廣闊應用前景。

5 討論與展望

真菌的遺傳背景比原核生物類細菌、放線菌等復雜得多,對其本身的揭示受到遺傳學、分子生物學等學科發(fā)展的限制。因此,現(xiàn)代生物技術(shù)如基因重組、基因克隆等還不能廣泛用于真菌育種工作。目前,大多真菌選育工作仍然主要靠經(jīng)典方法進行誘變,但誘變效率較低、適用方法有限。本文結(jié)合相關(guān)文獻與本課題組研究工作,介紹了將細胞壁通透性調(diào)控與已有育種技術(shù)組合的真菌育種新思路和方法,所述方法操作簡便、無需特殊儀器設備,在普通微生物實驗室就可完成所需全部實驗,因此易于實際應用。這對改善真菌育種誘變效率或部分克服經(jīng)典方法在真菌育種領(lǐng)域遇到的難點將有可能有所裨益。當然,對調(diào)控真菌細胞壁通透性而言,許多影響因素仍然十分復雜,首先需要考慮的是,采取哪種作用因子對所選原始菌的細胞壁進行調(diào)控比較適宜,調(diào)控程度如何控制等。這些影響因素有待通過系統(tǒng)研究來探索揭示。

微生物育種迄今主要集中在提高產(chǎn)能相關(guān)研究中,獲取新產(chǎn)物特別是活性新產(chǎn)物產(chǎn)生菌相關(guān)研究相對較少。但在藥源微生物資源開發(fā)研究中,如何將大量閑置的無活性菌株轉(zhuǎn)化為活性突變株,并從中尋找發(fā)現(xiàn)藥源活性新產(chǎn)物,從而有效拓展藥源活性菌株新資源具有極其重要的意義。這正是獲取活性新產(chǎn)物產(chǎn)生菌相關(guān)育種研究工作的意義之所在,而本文所述真菌細胞壁通透性調(diào)控育種新策略將有可能在真菌藥源活性菌株資源開發(fā)研究中得到廣泛應用并發(fā)揮重要作用。

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Regulation of the Permeability of Cell Wall for the Fungal Strain Breeding

TIAN Cong-Kui,CU ICheng-Bin,L IChang-Wei
(Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of M ilitary Medical Sciences,Beijing 100850,China)

Fungal cellwall is a specialo rganelle as the first barrier w hich the smallmolecules go in or out the cell.Thispaper introduces a new idea and app roaches for fungal strain breeding by regulating the permeability of fungal cell w all coup led with classical and conventionalmethods fo r m icroo rganism breeding.

microorganism;fungi;cell wall;strain breeding

Q93-3

A

1672-5174(2010)05-038-05

國家自然科學基金項目(30973631&30572279);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2007AA 09Z411);國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX09103-019,2009ZX09301-002);中國大洋協(xié)會國際海底區(qū)域研究開發(fā)項目(DYXM-115-02-2-09)和軍事醫(yī)學科學院科研創(chuàng)新基金重大專項(2008)資助

;2009-12-07;

2009-12-29作者簡介:田從魁(1981-),男,博士生。

**通訊作者:E-mail:cuicb@sohu.com,cuicb@126.com

責任編輯 徐 環(huán)