王佳楠 呂文河* 金光輝 白雅梅 李文霞

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶163319；3東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

馬鈴薯（SolanuMtuberosuML.）是世界第四大糧食作物，同時(shí)也是蔬菜、飼料、加工及工業(yè)原料作物（蔣敏華 等，2006）。晚疫病是危害馬鈴薯生產(chǎn)最為嚴(yán)重的病害之一。晚疫病菌（Phytophthora infestans）通常以無性生殖方式繁殖，當(dāng)存在A1和A2兩種交配型時(shí)，亦可通過有性的卵孢子進(jìn)行繁殖（李汝剛 等，1997）。P. infestans具有8～10條染色體（Sansome &Brasier，1973），基因組全長約237 Mb（Tooley & Therrien，1987），GC含量約52 %。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，EST-SSR標(biāo)記以其開發(fā)成本較低，高效迅速等優(yōu)點(diǎn)在植物病原菌遺傳多樣性研究中具有巨大的潛力。本試驗(yàn)在供試馬鈴薯晚疫病菌株均為 A1交配型的條件下，利用 21對EST-SSR引物分別對菌株與采集年份、菌株與地理來源的相關(guān)性進(jìn)行了分析，以期為馬鈴薯抗晚疫病育種等工作提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在晚疫病菌株與采集年份相關(guān)性分析研究中，選取 2005、2006、2008年同為采自黑龍江省哈爾濱市的17份菌株（均為A1交配型）作為試驗(yàn)材料（表1）；在晚疫病菌株與地理來源相關(guān)性分析研究中，選取同為 2006年采集，但分別來自黑龍江省加格達(dá)奇、哈爾濱、黑河、海倫、克山、青岡、訥河、綏化8個(gè)地點(diǎn)共計(jì)46份菌株（均為A1交配型）作為試驗(yàn)材料（表2）。EST-SSR引物采用已發(fā)表的21對EST-SSR引物（王佳楠，2009）。本試驗(yàn)于2009年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究室完成。

表1 2005、2006、2008年采自黑龍江省哈爾濱市的17份菌株

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EST-SSR分析 采用Pipe等（2000）的方法提取致病疫霉基因組DNA。PCR反應(yīng)體系:25 ng模板 DNA，0.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL 10×Buffer（Mg2+free），1.75 mmol·L-1MgCl2，15 pmol引物，1.2 UTaqDNA聚合酶，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在恒定60 W功率下電泳約1.5 h，銀染法染色。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，將有條帶的個(gè)體記為1，沒有的記為0，從而生成由1和0組成的原始矩陣。使用NTSYS-pc2.11a軟件（Rohlf，2000），對原始矩陣用SimQual程序求簡單匹配系數(shù)（simple matching coefficient），并獲得遺傳相似系數(shù)矩陣（similarity coefficient matrix），用SAHN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類樹狀圖。將聚類結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣（cophenetic matrix），用Mxcomp程序?qū)垲惤Y(jié)果和相似系數(shù)矩陣之間的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)。

表2 2006年采自黑龍江省8個(gè)地點(diǎn)的46份菌株

2 結(jié)果與分析

2.1 晚疫病菌株與采集年份相關(guān)性分析

利用已發(fā)表的 29對引物進(jìn)行多態(tài)性篩選（王佳楠，2009），引物全部能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物。選取能產(chǎn)生多態(tài)性且條帶清晰的21對引物（占72.4 %）分別對菌株與采集年份、菌株與地理來源的相關(guān)性進(jìn)行分析。

采用相似系數(shù)（Sm）以UPGMA法生成聚類樹狀圖（圖 1）。此外，將聚類結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣，對協(xié)表征矩陣和相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種矩陣顯著相關(guān)（r=0.746 05）。由圖 1可知，在相似系數(shù)為 0.87處聚類結(jié)果分為3組。其中，采于2005年的 3份菌株聚為第一類；而采于2005年的另2份菌株與采于 2006年的 4份菌株聚為第二類；采于2008年的8份菌株全部聚為第三類。據(jù)此，在相同地點(diǎn)采集的晚疫病菌株的聚類結(jié)果與采集年份之間具有一定的相關(guān)性。

圖1 2005、2006、2008年采自黑龍江省哈爾濱市的17份菌株聚類樹狀圖

2.2 晚疫病菌株與地理來源相關(guān)性分析

采用相似系數(shù)（Sm）以UPGMA法生成聚類樹狀圖（圖2）。此外，將聚類結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣，對協(xié)表征矩陣和相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行 Mantel檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種矩陣顯著相關(guān)（r=0.859 66）。由圖2可知，在相似系數(shù)為0.89處，分類趨勢比較明顯。采自加格達(dá)奇、綏化、訥河的菌株在聚類圖上親緣關(guān)系較近，采自青崗除 QG06-5（1）外的菌株、采自哈爾濱除 HE-1外的菌株、采自海倫除HL06-113外的菌株在聚類圖上親緣關(guān)系也較近，但采自克山和黑河的菌株分散于各個(gè)類群，沒有表現(xiàn)出聚類趨勢，可知采自克山和黑河的菌株遺傳背景較為復(fù)雜。據(jù)此，在相同年份采集的晚疫病菌株的聚類結(jié)果與地理來源之間具有一定的相關(guān)性。

圖2 2006年采自黑龍江省8個(gè)地點(diǎn)46份菌株聚類樹狀圖

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)在生物多樣性分析研究中具有很大的優(yōu)勢，Knapova和 Gisi（2002）的研究表明SSR標(biāo)記適合針對晚疫病菌基因型多樣性的研究。同AFLP相比，SSR技術(shù)具有位點(diǎn)特異的優(yōu)點(diǎn)，這樣更有利于分析馬鈴薯晚疫病菌的群體結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)是在本實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)9對具有多態(tài)性產(chǎn)物的EST-SSR引物基礎(chǔ)上，結(jié)合國外12對具有多態(tài)性產(chǎn)物的SSR引物，首次報(bào)道了黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌與采集年份和地理來源之間的關(guān)系。但客觀地講，由于受到SSR引物數(shù)量，特別是用于開發(fā) EST-SSR引物所需的高質(zhì)量晚疫病菌EST序列數(shù)量的限制，引物數(shù)量尚不充足，需要進(jìn)一步拓展SSR引物的開發(fā)策略，以期進(jìn)一步豐富SSR引物的數(shù)量。

在晚疫病菌遺傳多樣性與采集年份相關(guān)性研究方面，本試驗(yàn)聚類結(jié)果表明，在相同地點(diǎn)采集的晚疫病菌株的聚類結(jié)果與采集年份有一定相關(guān)性。由分析結(jié)果可知，黑龍江省哈爾濱市 2008年的菌株群體結(jié)構(gòu)與2005、2006年的菌株群體結(jié)構(gòu)存在明顯不同，即2008年菌株的群體結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。其原因可能是2007年黑龍江省內(nèi)罕見的干旱導(dǎo)致初侵染源發(fā)病情況發(fā)生變化，但具體原因尚須結(jié)合生理小種鑒定和抗藥性鑒定等群體表現(xiàn)型研究結(jié)果綜合考慮，作出更為全面的解釋。

在晚疫病菌遺傳多樣性與菌株地理來源相關(guān)性研究方面，采自克山和黑河的菌株分散于各個(gè)類群，沒有表現(xiàn)出聚類趨勢，這種情況可能與以下兩個(gè)原因有關(guān):第一，與克山地區(qū)菌株采樣的具體地點(diǎn)有關(guān)。來自克山地區(qū)的菌株有一少部分采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院的馬鈴薯育種田中，由于育種田中種植了部分引種材料和無性系材料，這些材料可能對晚疫病菌株存在篩選作用。第二，來自克山的另一部分菌株與來自黑河的菌株采自當(dāng)?shù)氐纳唐肥硖?，由于兩地種薯、商品薯的調(diào)運(yùn)比較頻繁，也會(huì)對當(dāng)?shù)赝硪卟【后w的遺傳結(jié)構(gòu)造成影響。因此，有理由認(rèn)為，來自克山和黑河的菌株遺傳背景比其他6個(gè)地點(diǎn)的菌株遺傳背景復(fù)雜。本試驗(yàn)結(jié)果與瑞士的Knapova和Gisi（2002）的報(bào)道有所不同，Knapova和Gisi（2002）的研究結(jié)果認(rèn)為用AFLP、SSR等分子標(biāo)記檢測的DNA多樣性與菌源的地理位置等無相關(guān)性，但Knapova和Gisi同時(shí)承認(rèn)，雖然SSR分子標(biāo)記能檢測出豐富的病菌群體結(jié)構(gòu)多樣性，但是只有少數(shù)的SSR基因型占統(tǒng)治地位，這可能與病害流行時(shí)以某些生理小種為主有關(guān)，不同地區(qū)的氣候條件、主栽品種、耕作制度不同，病原菌與寄主在長期適應(yīng)的過程中，適者生存，必然以某些類群為主，因此在試驗(yàn)結(jié)果上可能表現(xiàn)不出地理來源相關(guān)性。

在今后進(jìn)一步的研究中，隨著引物數(shù)量的不斷增加，可以進(jìn)一步采集來源更廣泛，采集年份更多的菌株，通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行聚類分析，從而更加準(zhǔn)確地分析馬鈴薯晚疫病菌EST-SSR遺傳多樣性是否與菌株的采集年份和地理來源具有相關(guān)性。

蔣敏華，楊清，李麗，黃先群．2006．馬鈴薯抗晚疫病轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展．種子，25（12）:46-50.

李汝剛，伍寧豐，范云六．1997．馬鈴薯抗晚疫病研究進(jìn)展．馬鈴薯雜志，11（4）:243-250.

王佳楠．2009．黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性EST-SSR分析〔碩士論文〕．哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué).

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