趙景輝,王再幸,王英平,趙偉剛,周麗斯,郭崇民,張鳳龍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林 吉林 132109)

葛根為豆科植物柴葛[Pueraria lobata(Willd.)Ohwi]和甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的干燥根,前者習(xí)稱柴葛,甘葛藤習(xí)稱“粉葛”[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味甘、辛,性平,具有增加腦及冠狀動脈血流量、降低血管阻力、收縮平滑肌、降血糖及解熱等多種功效[2]。民間用于治療傷寒、溫?zé)犷^痛、煩熱消渴等癥,也是中醫(yī)常用的祛風(fēng)解毒藥?，F(xiàn)代研究表明,葛根含葛根異黃酮,主要為葛根素(perarin)、大豆苷(daidzin)、大豆苷元(daidzein)3種活性成分,其中葛根素是本屬的特征成分,也是主要成分[3]其提取方法有冷浸、滲漉、超聲、加熱回流等,成本高、費時、費力,耗能巨大。本試驗以葛根素和浸膏得率為指標(biāo),采用正交試驗法優(yōu)化高頻電場提取工藝,具有快速、節(jié)能、低溫提取等特點。

1 儀器與試藥

1.1 實驗材料

葛根購于吉林市藥材站,經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所王英平研究員鑒定為柴葛[Pueraria lobata(Willd.)Oh wi]。

1.2 試藥

葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所,含量測定用,批號110752-200511),甲醇為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

LDT-100/4-25.2型中藥高壓脈沖電場提取裝置(長春華迪生物科技開發(fā)有限公司);OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化株式會社);電子天平ALC-210.4(Sartorius group);DZKW-D恒溫數(shù)顯水浴鍋(河北黃驊市航天儀器廠);101-3C型烘箱(上海實驗儀器廠);600 E高效液相色譜儀(美國Waters)。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗

溶劑濃度選擇。本試驗選擇了水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇等6種溶液為提取劑。以電場強度15kv/cm,脈沖數(shù)12個,料液比1∶10為提取參數(shù)。稱取葛根干品,粉碎至100目,分別稱取100 g,加入不同濃度的提取液浸濕、混勻,用泵將樣液打入中藥高壓脈沖電場提取裝置中進(jìn)行提取,所得提取液過濾后減壓濃縮至100m L,取2 m L用HPLC檢測葛根素含量,其他真空干燥至恒重,計算浸膏得率。結(jié)果見表1。經(jīng)比較可以看出以60%乙醇作為提取液,葛根素的得率最高。因此確定60%乙醇溶液為最佳提取劑。

表1 乙醇濃度的影響

2.2 正交實驗

2.2.1 因素水平設(shè)計。由于是連續(xù)流動進(jìn)樣提取,不考慮提取溫度、提取時間和提取次數(shù)的影響;又因為流速與脈沖數(shù)成相關(guān),所以影響提取的因素主要有:電場強度、脈沖數(shù)、料液比。采用L9(34)正交表優(yōu)化提取條件,重點考察上述三個因素,以浸膏得率和葛根素為考察指標(biāo),見表2。

表2 L9(34)實驗因素水平表

2.2.2 樣品制備。取葛根80目干品,分別稱取100 g,按L9(34)正交表所列實驗因素和實驗水平進(jìn)行試驗,所得提取液過濾后減壓濃縮至100m L,取2 m L用HPLC檢測葛根素含量,其他真空干燥至恒重,計算浸膏得率,見表3。

2.2.3 含量測定

2.2.3.1 色譜條件。色譜柱:Agilent Hypersil ODS,5μm,4.6×200mm;柱溫:25℃;流動相:甲醇-水(27 ∶73);流速:1.0m L/min;檢測波長:250nm;進(jìn)樣量10μL 。

2.2.3.2 對照品溶液的制備。精密稱取葛根素對照品0.41mg,置5m L的容量瓶中,加30%的乙醇溶解,并定容至刻度,搖勻,即得。

2.2.3.3 供試品溶液的制備。葛根不同濃度的乙醇提取液2m L,分別用30%的乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至100m L的容量瓶中,用30%的乙醇定容至刻度,再從中吸取1～10m L的容量瓶中,用 30%的乙醇定容至刻度,搖勻,即得。

2.2.3.4 線性關(guān)系的考察。分別精密吸取對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、1m L,置 5 個 1m L 的容量瓶中,加30%的乙醇定容至刻度,搖勻,備用。分別精密吸取上述濃度的溶液10μL,注入高效液相色譜儀檢測,記錄色譜圖及峰面積。以葛根素對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明葛根素在0.0082～0.082μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葛根標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3.5 樣品的測定。分別精密吸取葛根不同濃度乙醇提取液各10μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積,按外標(biāo)法計算各提取液中葛根素的含量。結(jié)果見表 1,表3。

表3 L 9(34)正交實驗結(jié)果

表4 葛根素正交實驗結(jié)果與分析

表5 葛根浸膏得率正交實驗結(jié)果與分析

經(jīng)過表3、表4、表5的直觀分析、方差分析和顯著性檢驗結(jié)果表明:影響葛根素提取的主次因素為C＞B＞A,即料液比＞脈沖數(shù)＞電場強度。最佳提取工藝為A2B2C3,即電場強度15 kv/cm,脈沖數(shù)為 10,料液比1∶14。影響葛根浸膏得率的主次因素為C＞B＞A,即料液比 ＞脈沖數(shù)＞電場強度。最佳提取工藝為A3B2C3,即電場強度20 kv/cm,脈沖數(shù)為10,料液比1∶14。方差分析可知,料液比對提取葛根素和葛根浸膏得率有顯著影響;電場強度、脈沖數(shù)對提取葛根素和葛根浸膏得率均無顯著影響。

由于A3B2C3組合并不在上述的正交試驗設(shè)計里,需另做一組正交試驗加以驗證。

2.2.4 提取工藝試驗驗證。取葛根干品,粉碎至100目,分別稱取100 g,按A3B2C3組合進(jìn)行試驗,所得提取液過濾后減壓濃縮至100m L,真空干燥至恒重,計算浸膏得率。重復(fù)驗證試驗(n=3),葛根浸膏得率為8.32%(占生藥),RSD=1.38%。

結(jié)果顯示:采用此方法提取,3次實驗結(jié)果中葛根浸膏得率均無明顯變化。

3 討論

本方法利用調(diào)制的高頻電流直接作用生物質(zhì)材料,使材料分子產(chǎn)生震蕩,激發(fā)了生物分子活性,使有效成分快速溶解在溶劑中。這種新的提取技術(shù)省略了一般提取時所需要的能量交換,能量傳導(dǎo)過程,提取所需要能量直接做功在生物分子上,因此比較其他提取方法節(jié)能50%以上。

國外自20世紀(jì)初開始利用高壓電場對牛奶進(jìn)行滅菌,以后逐漸發(fā)展到對各種食品滅菌[4]。進(jìn)入21世紀(jì),我國科技工作者將此技術(shù)應(yīng)用于中藥提取,并取得一定進(jìn)展。該技術(shù)用于葛根有效成分提取,具有提取時間短,1s以內(nèi);常溫提取,對葛根活性成分及風(fēng)味無影響;處理均勻,在電場中各部分的物料均受到相同大小場強的處理(電極邊緣除外);耗能小,對環(huán)境無污染等優(yōu)點。但是,應(yīng)當(dāng)根據(jù)需求采取不同的工藝參數(shù),若想得到大量提取物應(yīng)當(dāng)以電場強度20 kv/cm,脈沖數(shù)為10,料液比1∶14的參數(shù)進(jìn)行提取;如果以葛根素為目標(biāo)物則以電場強度15 kv/cm,脈沖數(shù)為10,料液比1∶14為參數(shù)進(jìn)行提取。

該方法穩(wěn)定、可行、適用于工業(yè)化生產(chǎn),可作為葛根的快速提取工藝。

[1]朱麗華,賀浪沖.葛根中有效部位及有效成分的高效液相色譜分析[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2005,26(3):216.

[2]張妤琳,梁敬鈺.葛根素的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2005,17(1):2.

[3]王言才,段金廒,華永慶,等.不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥 2008,19(1):132-133.

[4]曾新安,陳勇.脈沖電場非熱滅菌技術(shù).1版[M].中國輕工業(yè)出版社,2005.