鄭靜,李麗梅,陽泰,劉陽,劉進(jìn),李敏惠,楊淑霞,鄒強(qiáng)

(成都醫(yī)學(xué)院1.科研實(shí)驗(yàn)中心,2.藥學(xué)系2006級(jí)藥物制劑本科班,四川 成都 610083)

基因敲除小鼠(gene knockout mouse)是利用基因敲除技術(shù)使正常實(shí)驗(yàn)小鼠的基因組特定位點(diǎn)上目的基因失活,經(jīng)過繁殖篩選后所得到目的基因表達(dá)缺陷小鼠,是研究被敲除的目的基因的理想實(shí)驗(yàn)材料[1-3]。為了獲得可靠的動(dòng)物模型,基因敲除小鼠在用于實(shí)驗(yàn)研究前,必須進(jìn)行準(zhǔn)確、可靠的基因型鑒定,目前所采用的方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和 Southern雜交。Southern雜交雖然準(zhǔn)確性相當(dāng)高,但是實(shí)驗(yàn)步驟比較復(fù)雜、工作周期較長(zhǎng),而且花費(fèi)比較高;PCR法因其具有快速、靈敏、費(fèi)用低等特點(diǎn),逐漸取代了傳統(tǒng)的Southern雜交,被廣泛應(yīng)用于對(duì)基因敲除小鼠基因型的鑒定實(shí)驗(yàn)中[4,5]。但在PCR擴(kuò)增中,如果實(shí)驗(yàn)條件不合適,如引物設(shè)計(jì)不合理、模板DNA質(zhì)量不高或被污染、反應(yīng)體系中各成分因子比例失衡、PCR儀溫控不準(zhǔn)確、人為操作失誤等,都容易導(dǎo)致不可靠或無可重復(fù)性的PCR擴(kuò)增結(jié)果[6]。

本實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了補(bǔ)體C3基因敲除小鼠,補(bǔ)體C3基因的敲除是通過插入Neo基因后導(dǎo)致補(bǔ)體C3基因失活實(shí)現(xiàn)的。在最初對(duì)補(bǔ)體C3基因敲除小鼠基因型鑒定實(shí)驗(yàn)中,依照常規(guī)的引物設(shè)計(jì)思路,根據(jù)插入的Neo基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,但是由于Neo基因是實(shí)驗(yàn)室常用的表達(dá)克隆載體,我們發(fā)現(xiàn)不論在DNA提取過程中還是PCR反應(yīng)體系配制過程中,都存在模板DNA被外源Neo基因污染的風(fēng)險(xiǎn),從而造成假陽性的出現(xiàn)。另外,由于PCR擴(kuò)增反應(yīng)不充分等因素,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不清晰的電泳條帶,加大了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠性。所以,本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)了引物設(shè)計(jì)的方法,針對(duì)兩個(gè)基因(Neo和C3)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,有效地避免了因模板DNA的污染而造成的假陽性。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)PCR反應(yīng)各個(gè)因素的反復(fù)優(yōu)化,建立了一套有效可靠的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,并且當(dāng)PCR反應(yīng)的某個(gè)因素發(fā)生改變時(shí),如改變退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度及循環(huán)次數(shù),在一定的變化范圍內(nèi),PCR擴(kuò)增仍能達(dá)到理想的效果,同時(shí),通過對(duì)不同濃度模板DNA的擴(kuò)增,檢測(cè)PCR優(yōu)化體系的反應(yīng)靈敏性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 補(bǔ)體C3基因敲除小鼠(stock number:003641)從美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室引進(jìn),品系為B6.129S4-C3tmlCrr,雌、雄雜合子小鼠(C3+/-)各6只。

1.1.2 主要試劑 全基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司;PCR反應(yīng)緩沖液(不含Mg2+)、dNTP、Mg2+及Taq DNA聚合酶均購自MBI公司;PCR檢測(cè)引物由上海生工合成;電泳級(jí)瓊脂糖購自西班牙BIOSCIENCE公司;DNA標(biāo)準(zhǔn)品D2000購自Solarbio公司。

1.1.3 主要儀器 Thermo Biofuge stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);BioRad PCR擴(kuò)增儀PTC-200;Bio-Rad電泳及凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠全基因組DNA的提取 補(bǔ)體C3基因敲除小鼠共12只,各取外周血120μ l,按照DNA提取試劑盒提取小鼠全基因組DNA。每個(gè)樣品取10 μ l進(jìn)行混合,制備成混合模板,電泳鑒定與分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量和純度,混合模板用于PCR反應(yīng),保存于-20℃.

1.2.2 引物合成 引物1:針對(duì)插入片段Neo基因上的序列(5＇-CGG CAT TCT GCA CGC T TC AA-3＇);引 物 2:針 對(duì)補(bǔ) 體 C3 基 因上 的序 列(5＇-GT T CAT TCA GGG CAC CGG ACA-3＇),擴(kuò)增片段為280 bp,由上海生工合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)體系為 25 μ l:0.5 μ l dNTP(10 mmol/L),3 μ l MgCl2(25 mmol/L),2.5 μ l 10 ×PCR 緩 沖 液(不 含Mg2+),0.25 μ l引物 1(20 μ mol/L),0.25 μ l引物2(20 μ mol/L),0.2 μ l Taq DNA 聚合酶(5 U/μ l),2 μ l DNA 模板 ,超純水補(bǔ)至 25 μ l.

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃變性3 min;94℃變性20 s,64℃退火30 s,72℃延伸35 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min.取PCR產(chǎn)物10 μ l于 2%瓊脂糖凝膠電泳,D2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系的檢測(cè) 在初步建立的PCR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上,分別通過改變Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度,分析各種因素對(duì)PCR結(jié)果的影響。在改變PCR反應(yīng)體系中某因素時(shí),其它條件保持不變。

1.2.5 PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的檢測(cè) 采用20、25、30、35、40、45個(gè)循環(huán)次數(shù)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。

1.2.6 PCR靈敏性檢測(cè) 對(duì)混合DNA進(jìn)行兩倍稀釋,得到不同濃度的模板DNA用于PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 Mg2+濃度

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了 8個(gè) Mg2+濃度梯度,分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 和 4 mmol/L,結(jié)果表明,當(dāng)Mg2+濃度低于1.5 mmol/L時(shí)擴(kuò)增不出任何結(jié)果,Mg2+濃度在2-4 mmol/L的濃度范圍內(nèi),PCR擴(kuò)增均能得到較為清晰的條帶,而且沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(圖1)。

2.2 引物濃度

對(duì)引物進(jìn)行兩倍稀釋,共設(shè)置了8個(gè)濃度梯度,分別為 0.003125、0.00625、0.0125 、0.25、0.05、0.1、0.2 和 0.4 μ mol/L.結(jié)果顯示 ,隨著引物濃度的降低,擴(kuò)增得到的特異性片段量越少,電泳條帶亮度越低,當(dāng)引物濃度低于 0.0125 μ mol/L時(shí),擴(kuò)增不出特異性條帶,而當(dāng)引物濃度達(dá)到0.1 μ mol/L時(shí),得到的引物二聚體逐漸增多,但是在0.0125-0.4 μ mol/L范圍內(nèi)均未出現(xiàn)非特異性條帶(圖2)。

圖1 不同Mg2+濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響Fig.1 The products of PCR under different Mg2+concentration

圖2 不同引物濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響Fig.2 The products of PCR under different primer concentration

2.3 循環(huán)次數(shù)

分別采用 20、25、30、35、40、45 個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果可見,循環(huán)次數(shù)在20和25則無法擴(kuò)增出足夠的特異性條帶,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,電泳條帶亮度越高,但并無非特異性帶的產(chǎn)生,采用30-45個(gè)循環(huán)卻可以擴(kuò)增出單一的特異性條帶(圖3)。

2.4 退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

應(yīng)用PCR儀的溫度梯度功能對(duì)50℃-70℃的退火溫度進(jìn)行多次篩選,相應(yīng)的退火溫度值分別為50.5、51.5、55.5、58.4 、61.8、64.6、68.4、69.6℃。50.5、51.5℃時(shí)泳道均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶,55.5℃-69.6℃時(shí)泳道的特異性擴(kuò)增條帶非常清晰(圖4)。

圖3 不同循環(huán)次數(shù)對(duì)PCR結(jié)果的影響Fig.3 The products of PCR in different cycles

圖4 不同退火溫度對(duì)PCR結(jié)果的影響Fig.4 The products of PCR in different annealing temperature

2.5 PCR優(yōu)化體系靈敏度檢測(cè)

通過調(diào)整體系中模板DNA濃度,檢測(cè)優(yōu)化后PCR反應(yīng)的靈敏性,加入反應(yīng)體系的DNA體積為2 μ l.ND1000分光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果顯示,本次實(shí)驗(yàn)所用的模板DNA濃度為90 ng/μ l,對(duì)模板DNA進(jìn)行兩倍稀釋,得到的濃度分別為 45、22.5、11.25、5.63 、2.81、1.41 和 0.7 ng/μ l.結(jié)果可見,DNA 濃度越高,擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶越清晰,DNA濃度為0.7 ng/μ l時(shí),無法擴(kuò)增出任何結(jié)果,因此優(yōu)化后的PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)的最低DNA濃度為1.41 ng/μ l,即DNA的總量約2.82 ng(圖5)。

圖5 不同DNA濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響Fig.5 The products of PCR in different DNA concentration

3 討論

PCR技術(shù),是一種體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù),在反應(yīng)過程中,目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng),可在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬個(gè)特異性DNA序列的拷貝[7]。PCR反應(yīng)的各個(gè)要素,如Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等都會(huì)影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果[8]。Mg2+濃度過低,酶的活力降低,濃度過高,則催化生成非特異性條帶;引物濃度過低,影響引物與模板的結(jié)合,無法獲得足夠的PCR產(chǎn)物,引物濃度過高,容易由于引物間相互結(jié)合產(chǎn)生過多引物二聚體,甚至增大錯(cuò)配的幾率,產(chǎn)生非特異性條帶;PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)少,產(chǎn)物量低,無法進(jìn)行電泳檢測(cè),循環(huán)次數(shù)太多,反應(yīng)體系中的各種反應(yīng)試劑消耗完,反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期之后,則可能會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶。因此,各反應(yīng)因子的優(yōu)化組合是獲得特異性、可重復(fù)性PCR擴(kuò)增結(jié)果的前提,也是擴(kuò)增反應(yīng)是否成功的決定因素。另外,模板DNA質(zhì)量與濃度也是PCR反應(yīng)成功的一個(gè)重要條件,模板DNA量必須保證在PCR能夠檢測(cè)的范圍之內(nèi),過低量的模板DNA,無法擴(kuò)增出特異性片段;在提取模板DNA的過程中,除了避免由于實(shí)驗(yàn)材料、試劑、人為操作等多方面影響而帶入的污染以外,也要考慮到模板DNA之間的交叉污染。

本實(shí)驗(yàn)室為了避免由于模板DNA污染引起假陽性結(jié)果出現(xiàn)而采取了一些相應(yīng)的手段。一方面,改進(jìn)了PCR引物的設(shè)計(jì)方法;另一方面,本實(shí)驗(yàn)室工作人員采用在不同的實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行DNA提取和配置PCR反應(yīng)體系的工作,利用空間的分割從最大程度上避免DNA的外源性污染,在DNA提取的過程中采用了過柱的方法,避免了模板DNA之間的交叉性污染。后期的實(shí)驗(yàn)證明,本實(shí)驗(yàn)室后期采用的這兩種方法有效地避免了假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)。

其次,在設(shè)計(jì)了有效引物之后,本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)建立了一套穩(wěn)定可靠的PCR體系,這個(gè)PCR體系能夠在PCR反應(yīng)中各個(gè)因素發(fā)生不同程度的改變時(shí),也能夠擴(kuò)增出單一、清晰的產(chǎn)物條帶,得到穩(wěn)定可靠的鑒定結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該反應(yīng)體系Mg2+濃度在2-4 mmol/L,引物濃度在0.025-0.4 μ mol/L,循環(huán)次數(shù)在 30-45之間均能擴(kuò)增得到清晰均一的特異性條帶;同時(shí),引物退火溫度在55.5℃-69.6℃范圍內(nèi)均適用;另外,通過對(duì)不同濃度模板DNA的擴(kuò)增檢測(cè)了優(yōu)化后PCR體系的靈敏性,當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為1 U時(shí),能夠檢測(cè)的最低DNA濃度為1.41 ng/μ l,即模板DNA在反應(yīng)體系中的總量為約2.82 ng.本次實(shí)驗(yàn)證明,通過對(duì)補(bǔ)體C3基因敲除小鼠基因型鑒定的PCR條件優(yōu)化,構(gòu)建一套可靠、容錯(cuò)率高、適用范圍廣的PCR體系,可以避免由于每次實(shí)驗(yàn)操作或儀器溫度控制的不穩(wěn)定性對(duì)PCR反應(yīng)造成的影響,確保每次實(shí)驗(yàn)都能夠避免非特異性條帶的產(chǎn)生,得到清晰、可靠的結(jié)果。

目前,PCR法已經(jīng)成為基因敲除小鼠基因型鑒定最為常用的一種方法,通常根據(jù)插入基因片段的序列或者替代基因的序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)小鼠基因型。本實(shí)驗(yàn)室在以往對(duì)基因敲除小鼠基因型鑒定的工作過程中發(fā)現(xiàn),這種方法設(shè)計(jì)的引物往往會(huì)在PCR過程中因?yàn)橥庠葱訢NA污染而出現(xiàn)假陽性,出現(xiàn)的概率由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)污染源的控制嚴(yán)格程度不同而定,但即使在要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室中,偶爾出現(xiàn)了假陽性也很難察覺。因此,在進(jìn)行基因型鑒定過程中,有效避免外源性污染帶入的不可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就顯得非常重要。本實(shí)驗(yàn)利用引進(jìn)小鼠是通過插入Neo基因后導(dǎo)致補(bǔ)體C3基因失活構(gòu)建的原理,將引物設(shè)計(jì)為一條針對(duì)插入片段Neo基因上的序列,而另一條針對(duì)補(bǔ)體C3基因上的序列,只有當(dāng)模板DNA滿足于既有Neo基因又有補(bǔ)體C3基因并且兩個(gè)基因相連時(shí),才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這種引物的設(shè)計(jì)理念區(qū)別于根據(jù)一個(gè)基因來設(shè)計(jì)引物的普遍觀念,大大降低了PCR過程中假陽性的出現(xiàn),不但為基因敲除動(dòng)物基因型的鑒定提供了新的實(shí)驗(yàn)思路,也能應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)基因物種的鑒定,有助于設(shè)計(jì)更為適用的引物,構(gòu)建得到穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性高的PCR體系。

總之,PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果受諸多因素的影響,為了保證能夠得到穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在建立一個(gè)新的PCR反應(yīng)體系或者改變已經(jīng)形成的一個(gè)成熟體系時(shí),對(duì)各個(gè)因素的優(yōu)化是非常必要的。除了PCR實(shí)驗(yàn)中涉及到的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以外,儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)試劑、操作手法等因素都可能對(duì)PCR擴(kuò)增的結(jié)果產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)室通過改進(jìn)PCR引物的設(shè)計(jì)方法,反復(fù)優(yōu)化PCR反應(yīng)因子,得到了一套穩(wěn)定的PCR檢測(cè)方法。經(jīng)過本次實(shí)驗(yàn),證明了這套方法在PCR某因素發(fā)生一定改變的情況下,仍能夠擴(kuò)增出單一、穩(wěn)定、可信的PCR產(chǎn)物,適用于之后大量的補(bǔ)體C3基因敲除小鼠繁育鑒定實(shí)驗(yàn)中。同時(shí),實(shí)驗(yàn)過程中利用空間的分割避免了DNA的外源性及交叉性污染,進(jìn)一步提高了PCR結(jié)果的可靠性。

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