陳敏玲 方群 莊廣倫 羅艷敏 陳寶江 何志明 陳筠虹 陳涌珍

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科胎兒醫(yī)學(xué)中心,廣東廣州 510080)

近年來全社會(huì)雙胎發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì),究其原因與輔助生育技術(shù)發(fā)展、高齡孕婦增多以及促排卵藥物使用有關(guān)。雙胎妊娠與單胎妊娠比較,不良妊娠結(jié)局發(fā)生率明顯增高。約83%的雙胎妊娠合并有1種以上的妊娠并發(fā)癥。迄今,對(duì)于雙胎不良妊娠結(jié)局的原因尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)HLAG基因第8外顯子上3'非翻譯區(qū)的14bp缺失/插入(14-bp/14+bp)多態(tài)性對(duì)于妊娠維持具有重要作用,可能影響妊娠結(jié)局。本研究采用多聚酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)檢測(cè)雙胎胎盤該位點(diǎn)的多態(tài)性,探討雙胎H LA-G第8外顯子基因多態(tài)性分布,并探討其與雙胎妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2003年11月至2005年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院分娩的雙胎病例共125例,追蹤妊娠結(jié)局,各種產(chǎn)科合并癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第 6版)。孕婦平均年齡(30.1±4.1)歲,平均孕次1次,產(chǎn)次2次,平均分娩孕周(35.3±2.8)周(22～39周)。輔助生殖受孕66例(52.8%),自然受孕59例(47.2%);雙絨毛膜雙胎76例(60.8%),單絨毛膜雙胎49例(39.2%,其中有1例為輔助生殖技術(shù)ICSI受孕,其余48例均為自然受孕)。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標(biāo)本取材及處理 在知情同意下,胎盤娩出后,立即在各胎兒臍帶附著點(diǎn)對(duì)應(yīng)處自胎盤母體面向胎兒面剪切胎盤組織約5 g。在冰生理鹽水中反復(fù)漂洗,去除血液,分裝凍存管中,液氮凍存半小時(shí)后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用飽和酚、氯仿的方法提取胎盤的基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增HLA-G第8外顯子基因 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物,由大連寶生物技術(shù)有限公司合成,序列如 下 :GE14 HLA-G:5′-GTG ATG GGC TGT TTA AAG TGT CAC C-3′;RHG4:5′-GGA AGG AAT GCA GTT CAG CAT GA-3′;β-actin 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 5′–GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA – 3′;5′–GTC CT T AAT GTC ACG CAC GAT T TC – 3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為548 bp。PCR反應(yīng)體系為 50 μ L,其中模板 DNA 500 ng,10×PCR反應(yīng)液 5 μ L,10 U/μ L Taq 酶(TaKaRa 公 司)0.5 μ L,10 mmol/L dNTPs 4μ L,10 μ mol/L 上下游引物各 1μ L 。PCR反應(yīng)條件為:94℃5 min預(yù)變性,94℃30 s,58℃50 s,72 ℃60 s,循環(huán)35次,延伸72 ℃10 min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳 ①選擇合適的垂直電泳槽;②配置凝膠液:配方見試劑配制;③灌置凝膠:凝膠液配好后,充分混勻,凝膠液體沿著一側(cè)玻璃板注入,漸及底部,乃至全部充盈兩層玻璃板夾縫。膠液灌好后,在玻璃板上方插入齒梳。在室溫下讓凝膠聚合約45 min;④配制電泳緩沖液:配制1XTBE電泳緩沖液1 000 ml,分別加入到上下電泳槽中。將玻璃板插入電泳槽中,夾緊,倒入電泳液;⑤電泳:小心取出梳子,立即用緩沖液沖洗加樣孔,取出 PCR 產(chǎn)物10 μ l,加入上樣緩沖液2 μ l混勻 ,用移液槍將混合液加入預(yù)先制備好的8%聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔中,垂直電泳儀100 V 10 min,60 V電泳6小時(shí);⑥根據(jù)指示劑遷移位置來判定是否終止電泳,下膠;⑦按常規(guī)硝酸銀染色,固定:清潔洗槽,將有凝膠的玻璃板面向下,凝膠浸入固定液中,使凝膠與玻璃板分離,固定30 min;凝膠用蒸餾水清洗;1%硝酸浸泡10 min,用蒸餾水清洗;染色:將凝膠浸入顯色液中,出現(xiàn)電泳帶,加入終止液,凝膠用蒸餾水清洗;⑧使用干膠儀制成易于保存的圖片。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定 選取-14 bp/-14 bp和+14 bp/+14 bp各1條帶,切膠、純化,送英韋創(chuàng)津公司測(cè)序。①PCR產(chǎn)物直接純化,純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序,DNA純度要求:OD260/OD280=1.6～2.0、DNA濃度要求:PCR產(chǎn)物10 ng/μ L;②測(cè)序PCR反應(yīng)。配制Master Mix后在熱循環(huán)儀GeneAmp PCR 9600上進(jìn)行DNA擴(kuò)增:

反應(yīng)體系:

DNA(200 ng/μ L) 1μ L

BigDye Mix 8 μ L

Primer(3.2pmol/μ L)1 μ L

滅菌去離子水 10 μ L

總體積 20 μ L

反應(yīng)條件:先進(jìn)行98℃2 min預(yù)變性,再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(96℃10 s變性,50℃5 s退火,60℃4 min延伸),最后4℃保溫。③純化測(cè)序PCR產(chǎn)物,電泳樣品配制和變性,在上述乙醇揮發(fā)干的樣品中加入12 μ L的 Hi-Di Formamide;上樣毛細(xì)管電泳。④毛細(xì)管電泳。⑤使用Sequence Analysis軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS13.0軟件包完成,以2個(gè)胎盤14+bp等位基因出現(xiàn)總頻數(shù)分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),3組間均數(shù)之間的比較采用ANOVA方法和分層分析。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳結(jié)果 第8外顯子存在1個(gè)14 bp刪除/插入位點(diǎn)(14-bp/14+bp)多態(tài)性,14-bp基因型可擴(kuò)增出 210 bp的片斷,而 14+bp基因型產(chǎn)生224 bp的條帶,雜合子可見210 bp和224 bp的2條片段。采用北京天為時(shí)代科技有限公司的pBS DNA/Hae III作為DNA marker(見圖1)。

圖1 HLA-G第8外顯子基因8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果marker:PBR DNA/HaeⅢladder(213bp/234bp)

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 與GenBank Blast比對(duì),224 bp產(chǎn)物比210bp產(chǎn)物多出了1個(gè)14 bp的基因序列:AT T TGT TCA TGC CT(見圖2)。與文獻(xiàn)報(bào)道[1]一致。

圖2 HLA-G第8外顯子測(cè)序圖

2.3 不同基因型雙胎妊娠合并癥比較(見表1)。雙胎14+bp等位基因出現(xiàn)總頻數(shù)與雙胎妊娠結(jié)局的關(guān)系(見表2)。

其他內(nèi)科合并癥包括:甲亢、肝炎、血小板減少性紫癜等從上面2個(gè)表可見羊水過多與雙胎輸血綜合征與雙胎間基因是否一致有顯著性關(guān)系(P＜0.05),這與單絨毛膜雙胎雙胎間基因一致性較高有關(guān)。其余合并癥與雙胎盤是否基因一致無(wú)關(guān)。2個(gè)胎兒基因型分布順序?qū)y(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)影響(P＞0.05)。2胎14+bp等位基因出現(xiàn)總頻數(shù)在出現(xiàn)子癇前期雙胎中有顯著性差異,且經(jīng) Ridit檢驗(yàn)證實(shí)子癇前期發(fā)生率與2胎14+bp等位基因總頻數(shù)有關(guān)(95%可信區(qū)間為0.189～0.288,P＜0.05)。小于32周早產(chǎn)與14+bp等位基因總頻率不同分組未見顯著性關(guān)系(P=0.058),但在胎兒攜帶4個(gè)14+bp等位基因組中比例較高(2例/6例)?？紤]到不同的絨毛膜性質(zhì)可能導(dǎo)致雙胎基因分組和其他其他變量的關(guān)系可能不同,故以絨毛膜性質(zhì)為分層因素(協(xié)變量)篩選與雙胎基因分組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素,分析方法:分類變量按照 CMH(Cochran-Mantel-Haenszel)法進(jìn)行分析;連續(xù)性變量采用協(xié)方差分析進(jìn)行分析。其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量為:子癇前期(P=0.0002)。

表1 不同基因型雙胎妊娠合并癥比較(n)

表2 雙胎14+bp等位基因總頻數(shù)與雙胎妊娠結(jié)局的關(guān)系[n(%)]

3 討論

3.1 HLA-G第8外顯子多態(tài)性與妊娠維持 無(wú)論是單胎抑或雙胎妊娠,成功妊娠的維持與母胎間正常的免疫耐受密切相關(guān)。早在20世紀(jì)50年代英國(guó)學(xué)者M(jìn)edawer就提出胎兒為半異體移植物的概念。HLA-G維持妊娠的機(jī)制包括:①直接或間接抑制蛻膜自然殺傷(dNK)細(xì)胞;②與蛻膜組織中的T細(xì)胞結(jié)合,抑制T細(xì)胞殺傷;③調(diào)節(jié)T輔助性細(xì)胞因子分泌,促使 Th2偏移;④可溶性HLA-G分子通過激活Fas/FasL旁路,引起活化母體CD8+T細(xì)胞的凋亡[2]。HLA-G多態(tài)性部位呈“成簇”趨勢(shì),主要分布在5個(gè)區(qū)域,包括由外顯子 2、3、4所編碼的具有抗原結(jié)合功能的結(jié)構(gòu)域、5'端上游調(diào)節(jié)區(qū)(5'URR)和外顯子8的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3'UTR),而在其他基因編碼區(qū)核苷酸序列變異較少,相對(duì)比較保守。1993年由 Harrison首次報(bào)道了H LA-G第8外顯子(14-bp/14+bp)多態(tài)性,在對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的MHC-G進(jìn)化過程研究中發(fā)現(xiàn),這種14bp多態(tài)性屬于缺失性多態(tài),而非插入性多態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)14+bp等位基因表達(dá)時(shí),外顯子8起始處1個(gè)92bp片斷被切除,結(jié)果表明被切除的 HLA-G mRNA(92-bp)可能比完整的HLA-G mRNA更穩(wěn)定而影響選擇性剪切。推測(cè)這一區(qū)域參與HLA-G轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其多態(tài)性變化和HLA-G mRNA表達(dá)水平和HLA-G的蛋白水平密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)HLAG第8外顯子中的14bp缺失/插入位點(diǎn)(14-bp/14+bp)多態(tài)性與妊娠維持的關(guān)系密切,成為關(guān)注熱點(diǎn)。越來越多報(bào)道該位點(diǎn)多態(tài)性與單胎自然流產(chǎn)、子癇前期、胎盤早剝等不良妊娠結(jié)局有關(guān)。但哪1種多態(tài)性有利于維持妊娠的結(jié)論有所不同。2002年Hviid等[3]發(fā)現(xiàn)孕婦14+bp/14+bp多態(tài)性與RSA明顯相關(guān);而2004年 Tripathi等[1]則認(rèn)為孕婦14-bp/14+bp基因型與RSA關(guān)系更加密切;2000年Bermingham等[4]發(fā)現(xiàn)子癇前期患者子代14-bp/14+bp基因型比率較高;2001年O'Brien及2004年 Hylenius等[5]認(rèn)為胎盤 14+bp/14+bp基因型與子癇前期發(fā)病有關(guān)。

3.2 雙胎妊娠的維持 約83%的雙胎妊娠合并有1種以上的妊娠并發(fā)癥。雙胎妊娠早期流產(chǎn)發(fā)生率為5%,是單胎的2～3倍;和單胎妊娠相比,雙胎合并子癇前期,相對(duì)危險(xiǎn)率為2.04～4,且一旦并發(fā)子癇前期,病情往往較為嚴(yán)重,以中、重度為主;雙胎胎盤早剝發(fā)生率較單胎增高(4.7%比0.7%);胎兒發(fā)育受限發(fā)生率是單胎妊娠的10倍;單絨毛膜雙胎孕32周前的早產(chǎn)率為9.2%,雙絨毛膜雙胎為5.5%,而單胎妊娠僅為1%～2%。但迄今,對(duì)于雙胎容易發(fā)生子癇前期等不良妊娠結(jié)局的原因尚不明確。既往認(rèn)為雙胎妊娠由于子宮腔過大,引起子宮張力增高,容易引發(fā)流產(chǎn)和早產(chǎn),其次由于子宮腔增大后使胎盤嚴(yán)重缺血缺氧,胎盤抗氧化酶減少和活性下降,胎盤局部出現(xiàn)氧化應(yīng)激,引起脂質(zhì)過氧化和絨毛間隙的白細(xì)胞活化,加劇氧化應(yīng)激,從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞激活功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷,使雙胎妊娠較單胎更易發(fā)生母兒嚴(yán)重并發(fā)癥。但是這一理論并不完善,有學(xué)者對(duì)羊膜腔內(nèi)壓力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)雙胎妊娠過程中子宮腔內(nèi)壓力并沒有明顯增加[3]。因此雙胎妊娠的維持機(jī)制尚未明了,其妊娠期的免疫耐受狀況目前也尚不清楚,但早在20世紀(jì)70年代,就有學(xué)者提出雙胎妊娠較單胎妊娠攜帶的組織相容性抗原量明顯增高,推測(cè)這種特殊的胎兒抗原超負(fù)荷對(duì)妊娠結(jié)局有一定的影響。從關(guān)于基因多態(tài)性的研究中也發(fā)現(xiàn)雙胎妊娠胎兒某些基因的多態(tài)性對(duì)妊娠結(jié)局可產(chǎn)生影響,如胎兒攜帶IL-1拮抗受體第2等位基因(IL1RN*2)的總頻數(shù)與雙胎發(fā)生胎膜早破相關(guān),且顯著增加圍產(chǎn)兒死亡率。若第1胎胎兒Fas基因啟動(dòng)子出現(xiàn)第 670位的 A→G的單核苷酸突變(TNFRSF6),則雙胎發(fā)生未足月胎膜早破(PPROM)的幾率顯著性增高[4]。單胎妊娠中H LA-G第8外顯子多態(tài)性與妊娠結(jié)局相關(guān)的研究結(jié)果是否在雙胎妊娠上適用,目前尚未見相關(guān)報(bào)道,是值得探討的問題。

3.3 H LA-G第8外顯子基因多態(tài)性與雙胎妊娠合并癥的關(guān)系 文獻(xiàn)報(bào)道雙胎妊娠合并子癇前期發(fā)生率約為11.8%～37%[5],與本文結(jié)果相符。子癇前期的發(fā)生與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕功能降低有關(guān),妊娠初期,當(dāng)滋養(yǎng)干細(xì)胞分化為細(xì)胞滋養(yǎng)層后,由增殖表型轉(zhuǎn)化為侵蝕表型,標(biāo)志為HLA-G、基質(zhì)金屬蛋白酶及黏附分子受體類型的改變,之后其生理性血管重鑄發(fā)生異常。因此子癇前期的發(fā)生與H LA-G密切相關(guān)。體外培養(yǎng)的子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)H LA-G的表達(dá)下降,本研究亦證實(shí)H LA-G第8外顯子多態(tài)性與雙胎子癇前期的發(fā)生可能有關(guān)。本研究中雙胎妊娠合并子癇前期發(fā)病率為12.8%,在子癇前期組中14+bp/14+bp基因型比率顯著增高,此結(jié)果與2008年國(guó)外的研究結(jié)果[6]相一致,該文獻(xiàn)報(bào)道單胎胎盤HLA-G第8外顯子14+bp序列的存在與子癇前期的發(fā)生有關(guān),認(rèn)為此序列的存在影響HLA-GmRNA的類型和蛋白表達(dá),從而對(duì)子癇前期的發(fā)病起重要作用。

雙胎妊娠特有的合并癥(如雙胎輸血綜合征、雙胎不同一性等)與胎盤14 bp基因多態(tài)性未見明顯關(guān)系。羊水過多與雙胎輸血綜合征與雙胎間基因是否一致有顯著性關(guān)系(P＜0.05),這與單絨毛膜雙胎雙胎間基因一致性較高有關(guān)。因?yàn)殡p胎輸血綜合征、羊水過多與單絨毛膜性質(zhì)有關(guān),所以在雙胎基因一致組中多見。雙胎不同一性與胎盤14 bp基因多態(tài)性無(wú)關(guān),推測(cè)不同一性雙胎胎兒的體重和表型的不一致與免疫因素關(guān)系不大,需從另外角度探討,可能和雙胎間遺傳異質(zhì)性、X染色體失活偏離、胎盤血供和宮內(nèi)環(huán)境差異有關(guān)。

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