王 哲， 馬 鐵， 楊向紅△

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1輸血科，2病理科，遼寧 沈陽 110004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是當(dāng)前終末期腎病最常見原因之一。在糖尿病的發(fā)病機制中氧化應(yīng)激被認為是中心環(huán)節(jié)，因為它不僅能促進高級糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的形成，還能導(dǎo)致DNA損傷、一氧化氮(nitric oxide，NO)合成減少和失活，以及促進蛋白激酶C絲裂原活化蛋白激酶(protein kinases C－mitogen－activated protein kinases，PKC － MAPK)激活［1］。因此，應(yīng)用抗氧化劑治療糖尿病腎病成為臨床研究熱點［3］。血紅素氧合酶1(heme oxygenase－1，HO －1)又稱為熱休克蛋白 32(heat shock protein－32，HSP32)，廣泛存在于哺乳動物的微粒體中。近年研究發(fā)現(xiàn)，HO－1在各種應(yīng)激過程中均有適應(yīng)性表達［2］。由于糖尿病本身的特殊性以及微血管與大血管相比無論是組織來源還是形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能作用方面都存在差異，有關(guān)AGEs對腎臟微血管內(nèi)皮細胞中ROS含量以及HO－1表達影響相關(guān)的體外研究甚少。因此，我們在體外建立糖尿病腎臟微血管病變的體外模型的基礎(chǔ)上，觀察AGEs對大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細胞(rat renat microvascular endotheliat cells，RMECs)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成以及HO－1表達的影響，探討抗氧化劑丙丁酚(又名普羅布考，probucol)和辛伐他汀的作用機制，以尋求防治糖尿病腎病的有效方法。

材料和方法

1 動物與試劑

3－8 d齡SD胎大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部);普羅布考原料藥、辛伐他汀原料藥(齊魯藥業(yè));胰蛋白酶(Biosharp);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Costar);兔抗鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原(Santa Cruz);Matrigel膠(BD);活性氧檢測試劑盒(南京建成);總RNA提取試劑Trizol(Bio Basic Inc.);TaKa-Ra RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(寶生物工程);兔抗鼠HO－1單克隆抗體(Santa Cruz)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒(北京中杉)。

2 原代RMECs分離培養(yǎng)與鑒定

參照Green等［4］的三步梯度篩網(wǎng)法收集200目網(wǎng)上腎血管球，然后應(yīng)用0.125%胰蛋白酶37℃消化分離腎小球后接種于RMECs培養(yǎng)液中(20%胎牛血清，DMEM，青、鏈霉素各1×105U/L，20 mg/L內(nèi)皮細胞生長因子，肝素鈉100 mg/L)。根據(jù)細胞貼壁速度不同的特點，應(yīng)用反復(fù)貼壁法逐步將微血管內(nèi)皮細胞分離。綜合形態(tài)學(xué)、免疫細胞化學(xué)和管腔樣結(jié)構(gòu)實驗對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。

3 糖基化修飾的牛血清白蛋白(advanced glycation end products－bovine serum albumin，AGE －BSA)的制備與檢測

將小牛血清白蛋白50 g/L與0.5 mmol/L葡萄糖溶于磷酸鹽緩沖液中，室溫放置過夜，對照組中不含葡萄糖，其余條件一致。過濾除菌后置37℃避光孵育3個月。實驗前置于透析膜中，去除未結(jié)合的葡萄糖。熒光光譜掃描檢測AGE－BSA。

4 實驗分組

取培養(yǎng)第3－6代RMECs進行實驗，先用無血清培養(yǎng)基同步化48 h后，再進行隨機分組。對照組，含RMECs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;AGE－BSA損傷組，先以對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)45 h，再更換為含100 mg/L AGE－BSA的培養(yǎng)基處理3 h;，probucol+AGE－BSA組，先加入含50 μmol/L probucol培養(yǎng)基處理 12 h，再更換為對照培養(yǎng)基培養(yǎng)33h，最后用含100 mg/L AGE－BSA的培養(yǎng)基處理3 h;simvastatin+AGEBSA處理組，先加入含50 μmol/L simvastatin培養(yǎng)基處理12 h，再更換為對照培養(yǎng)基培養(yǎng)33 h，最后用含100 mg/L AGE－BSA的培養(yǎng)基處理3 h。

5 RMECs中ROS含量的測定

采用2'，7'二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH－DA)熒光染色檢測各組細胞中ROS，流式細胞儀測定其熒光強度。

6 HO－1 mRNA水平的檢測

應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測定經(jīng)上述處理后的各組細胞HO－1 mRNA含量。提取細胞總RNA。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果，待測基因mRNA相對表達量以擴增帶吸光度與相應(yīng)內(nèi)參照擴增帶吸光度的比值表示。

7 HO－1蛋白的測定

Western blotting檢測HO－1蛋白表達，裂解液提取細胞蛋白水平，最后于DAB中顯色，30 min內(nèi)觀察結(jié)果。圖像采用凝膠成像分析系統(tǒng)獲得目的條帶和GAPDH的平均灰度值，以目的條帶與GAPDH的比值變化來衡量各基因表達的相對變化。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 RMECs的鑒定

光鏡下觀察細胞的形態(tài)，原代培養(yǎng)的RMECs呈多角形或短梭形，培養(yǎng)6－8 d后細胞融合成單層。熒光顯微鏡下觀測細胞陽性表達Ⅷ因子相關(guān)抗原。將傳代的內(nèi)皮細胞接種到matrigel上12 h后，光鏡下觀察細胞成血管樣結(jié)構(gòu)，見圖1。

Figure 1.Identification of rat renal microvascular endothelial cells(RMECs).A:primarily－cultured RMECs at 4 d exhibited short spindle－shaped cells(×100);B:morphology of RMECs after 8 d of culture(×100);C:cells positively expressed factorⅧ related antigen(immunofluorescence staining，×400);D:morphology of rat microvascular endothelial at passage 2 in the matrigel after 12 h of culture(×100).圖1 RMECs的鑒定

2 普羅布考和辛伐他汀對 AGE－BSA誘導(dǎo)的RMECs中ROS含量的影響

與對照組相比，AGE－BSA處理組大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細胞ROS含量明顯升高，是對照組的2.3倍，50μmol/L probucol和 simvastatin均可以抑制AGE－BSA升高活性氧的作用，見圖2。

Figure 2.Effect of probucol and simvastatin on ROS production induced by AGEs in RMECs..n=8.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGE－BSA.Lane 1:control;Lane 2:treatment with AGE－BSA;Lane 3:treatment with probucol+AGE－BSA;Lane 4:treatment with simvastatin+AGE－BSA.圖2 Probucol和simvastatin對AGE－BSA誘導(dǎo)的RMECs ROS含量的影響

3 RMECs中HO－1表達在各組間的比較

HO－1 mRNA表達在AGE－BSA損傷組(0.29±0.05)顯著高于對照組 (0.15±0.04)，P＜0.05，probucol+AGE－BSA組(0.17±0.07)與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，simvastatin+AGE－BSA組(0.24±0.06)與AGE－BSA組無顯著差異(P＞0.05)，見圖 3、表 1。

HO－1蛋白表達在AGE－BSA損傷組(0.48±0.04)顯著高于對照組 (0.25±0.05)，P＜0.05，probucol+AGE－BSA組(0.27±0.06)與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，simvastatin+AGE－BSA組(0.44±0.08)與AGE－BSA損傷組無顯著差異(P ＞0.05)，見圖4、表1。

Figure 3.The electrophoregram of RT－PCR of HO －1.M:DNA marker;1:treatment with AGE－BSA;2:treatment with probucol+AGE－BSA;3:treatment with simvastatin+AGE－BSA;4:control.圖3 RT－PCR擴增HO－1片段

表1 RMECs中HO－1表達在各組間的比較Table 1.The expression of HO－1 mRNA and protein in different groups(.n=8)

表1 RMECs中HO－1表達在各組間的比較Table 1.The expression of HO－1 mRNA and protein in different groups(.n=8)

*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGE－BSA.

Control 0.15 ±0.04 0.25 ±0.05 AGE － BSA 0.29 ±0.05* 0.48 ±0.04*Probucol+AGE － BSA 0.17 ±0.07△ 0.27 ±0.06△Simvastatin+AGE －BSA 0.24 ±0.06 0.44 ±0.08

Figure 4.Western blotting of HO －1 protein.1:treatment with AGE－BSA;2:treatment with probucol+AGE－BSA;3:treatment with simvastatin+AGE － BSA;4:control.圖4 HO－1蛋白質(zhì)印跡

討 論

原代培養(yǎng)的腎小球細胞主要是內(nèi)皮細胞，此外還有上皮細胞和系膜細胞。本實驗在培養(yǎng)液中添加了內(nèi)皮細胞生長因子和肝素鈉等，對選擇性促進內(nèi)皮細胞生長起到了重要作用。此外，根據(jù)細胞貼壁速度不同的特點進一步純化了微血管內(nèi)皮細胞。根據(jù)培養(yǎng)細胞呈多角形或短梭形的形態(tài)，Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性，在matrigel膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)，鑒定其為內(nèi)皮細胞來源。

研究表明，糖尿病大鼠內(nèi)皮細胞中氧化應(yīng)激與血漿中AGEs濃度有關(guān)，氧化應(yīng)激在糖尿病微血管并發(fā)癥中具有重要作用［5］。然而，目前為止，糖尿病腎病中氧化應(yīng)激的存在，特別是微血管內(nèi)皮細胞中氧化應(yīng)激存在還缺少直接證據(jù)。本文中采用DCFHDA熒光染色，流式細胞儀測定其熒光強度的方法清楚地觀察到AGEs導(dǎo)致腎臟微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS的存在。此外，實驗中觀察到抗氧化劑普羅布考和辛伐他汀均能顯著降低細胞內(nèi)ROS含量。

在多種疾病中細胞為了對抗氧化應(yīng)激，多種抗氧化物酶被誘導(dǎo)生成。HO－1就是其中一種重要的抗氧化物酶。HO－1是血紅素氧合酶的誘導(dǎo)型，能催化血紅素分解生成一氧化氮、膽紅素和鐵［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，HO－1在各種氧化應(yīng)激過程中均有適應(yīng)性表達［7］。本實驗中觀察到對照組內(nèi)皮細胞HO－1的表達微弱，AGEs作用下RMECs中HO－1 mRNA和蛋白水平均顯著增加;普羅布考能夠糾正AGEs導(dǎo)致的HO－1表達異常。由此，推斷出抗氧化劑普羅布考可能通過降低細胞內(nèi)ROS的生成來影響HO－1的表達。辛伐他汀是由土曲霉菌酵解產(chǎn)物合成的三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑類降脂藥物，除降脂外目前已在臨床上廣泛用于預(yù)防和治療冠心病，改善心肌缺血，降低冠心病死亡率。研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀還參與對細胞增殖、凋亡、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能的調(diào)控，其有類似于VEGF的作用［8，9］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對于保護腎功能，延緩糖尿病腎病發(fā)展具有積極地治療作用。本實驗中觀察到辛伐他汀能夠明顯抑制AGE－BSA導(dǎo)致的ROS含量增加，證實了辛伐他汀保護腎臟的功能可能與其具有抗氧化作用有關(guān)。然而，辛伐他汀并沒有改變AGE－BSA誘導(dǎo)的HO－1表達異常，說明它的抗氧化作用機制可能通過其它的細胞內(nèi)信號通路。

研究表明，HO－1及其代謝產(chǎn)物廣泛參與了抗氧化應(yīng)激、抗炎癥損傷、抗細胞增殖、抗凋亡、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血管張力及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程［10－12］。HO－1及其酶解產(chǎn)物一起組成強大的內(nèi)源性保護系統(tǒng)，在防治多種心血管疾病中均發(fā)揮著積極的作用。然而，本實驗所建立的大鼠體外模型中，普羅布考和AGE－BSA均能誘導(dǎo)HO－1表達增加。AGEs誘發(fā)的HO－1表達在抑制糖尿病腎病的發(fā)展中可能同樣具有積極作用。有關(guān)HO－1在糖尿病腎病中的確切功能仍然需要進一步探討。

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