曹愛華，孫惠青，徐金麗，徐光軍，鄭 曉，王秀國，李義強(qiáng)

（農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，煙草病蟲害監(jiān)測(cè)與綜合治理行業(yè)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

阿維菌素[1-2]（Avermectins,AVM）是一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，由鏈霉菌中灰色鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生。天然阿維菌素中含有8個(gè)組分，主要有4種，即A1a、A2a、B1a和B2a，其總含量≥80%；對(duì)應(yīng)的 4個(gè)比例較小的同系物是 A1b、A2b、B1b和B2b，其總含量≤20%。在8個(gè)組分中B組分的生物活性優(yōu)于A組分，其中以B1a組分活性最強(qiáng)，B1b也有一定的殺蟲活性。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽[3]（emamectin benzoate，以下簡(jiǎn)稱甲維鹽）是農(nóng)用抗生素阿維菌素B1結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物，具Bla、Blb兩種結(jié)構(gòu)體。目前作為一種新型農(nóng)畜兩用抗生素被廣泛應(yīng)用，可防治蔬菜、果樹、棉花、大豆、茶葉、煙草等作物上的鱗翅目、同翅目、鞘翅目和螨類等害蟲。其作用機(jī)理為增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸鹽和Y-氨基丁酸的作用，從而使大量的氯離子進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，使細(xì)胞功能喪失，擾亂神經(jīng)傳導(dǎo)，幼蟲在接觸藥劑后很快停止取食，發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的麻痹，藥劑也可滲透到目標(biāo)作物的表皮，使藥效期延長(zhǎng)。目前其檢測(cè)方法以高效液相色譜法為主，檢測(cè)器主要以紫外檢測(cè)器(UVD)[4-7]和熒光檢測(cè)器(FD)[8-10]為主，二極管陣列(DAD)[11]和紫外分光光度[12]檢測(cè)也有報(bào)道，4種檢測(cè)器以熒光檢測(cè)法(FD)靈敏度最高，其次為紫外檢測(cè)器(UVD)。由于熒光法需柱前衍生，前處理方法較繁瑣，故未采用。筆者參考以上幾種紫外檢測(cè)器(UVD)方法，根據(jù)煙草中雜峰干擾情況確定了以甲醇/水(88:12，V/V)為流動(dòng)相[4]，流速為1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)245 nm的儀器條件檢測(cè)煙草中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的殘留量，方法靈敏度為2.0×10-10g。殘留前處理方法也有多種報(bào)道：李再興等[4]采用二氯甲烷萃取以(UVD)檢測(cè)廢水中阿維菌素；李晶等[6]采用甲醇提取，florisil凈化的方法檢測(cè)梨中殘留分析；董靜等[11]采用乙腈提取ODSC18粉末和PSA粉末凈化的方法檢測(cè)蔬菜中阿維菌素，但未見煙草中的殘留分析方法的報(bào)道。筆者在參考以上幾種方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合煙草特點(diǎn)及甲維鹽特性，對(duì)煙草中甲維鹽的殘留分析方法進(jìn)行了探索和研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀—紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（Waters Alliance 2695/2487）、色譜柱Waters Sun Fire(C18,5.0 μm,4.6×150 mm)、回旋式震蕩器(HY-5)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA)、SPE凈化柱(Florisil-SPE,1g/6mL)。

1.1.2 試劑 丙酮(AR)、甲醇(HPLC)、二氯甲烷(AR)、氯化鈉(AR)、無水硫酸鈉(AR)、甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.5%，德國Dr.E公司)。

1.2 樣品處理與分析

1.2.1 樣品處理 稱取鮮煙葉樣品10.0 g（干煙葉4.0 g，土壤20.0 g）于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL丙酮/水（1:1，V/V），回旋式震蕩器振蕩提取1 h，過濾，取50 mL濾液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加50 mL 10%氯化鈉溶液，分別用50、40和30 mL二氯甲烷萃取3次，萃取液過無水硫酸鈉除水，收集于平底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干，土壤樣品用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm濾膜，待測(cè)定。煙葉樣品用2 mL二氯甲烷溶解，待凈化。凈化用Florisil-SPE柱，5 mL二氯甲烷預(yù)淋洗，將上述2 mL甲醇溶解液轉(zhuǎn)入柱中，用10 mL二氯甲烷分?jǐn)?shù)次淋洗，棄去淋出液。用20 mL丙酮/二氯甲烷(6:4，V/V)淋洗SPE柱，收集淋出液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干，用2 mL甲醇定容，待測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇/水（88:12，V/V），經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾；并進(jìn)行脫氣；流速：1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL

1.2.3 保留時(shí)間 甲維鹽在上述檢測(cè)條件下的相對(duì)保留時(shí)間為：B1b 5.9～6.4 min，B1a 7.1～7.2 min。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用甲醇配制100 mg/L的甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品母液，稀釋濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以甲維鹽進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)高效液相色譜測(cè)定峰面積(μv)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其一元線性回歸方程為：

相關(guān)系數(shù)r= 0.99717(B1a)、r= 0.99678(B1b)（圖1）。

圖1 甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 emamectin benzoate B1b and B1a Standard curve

2.2 最小檢出量和最低檢出濃度

在以上儀器條件下最小檢出量為：2.0×10-10g(B1a)；1.0×10-9g(B1b)。方法最低檢出濃度B1a：鮮煙葉0.002 mg/kg，干煙葉0.005 mg/kg，土壤0.001 mg/kg；B1b：鮮煙葉0.01 mg/kg，干煙葉0.02 mg/kg，土壤0.005 mg/kg。

2.3 添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

甲維鹽為B1a、B1b的混合物，在樣品測(cè)定時(shí)，殘留量為2種結(jié)構(gòu)體含量之和。以鮮煙葉（圖3）、干煙葉、土壤（圖4）對(duì)照樣品，分別添加3個(gè)不同濃度的甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液（圖3、4），每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣，按上述方法提取、凈化和檢測(cè)。結(jié)果表明，甲維鹽在鮮葉中添加濃度為 0.02、0.1、2.0mg/kg時(shí)，平均回收率99.76%～103.36%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 2.07%～4.33%；在干葉中添加濃度為0.02、0.5、2.0 mg/kg時(shí)，平均回收率 94.92%～102.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.66%～3.69%；在土壤中添加濃度為0.005、0.02、2.0 mg/kg時(shí)，平均回收率96.76%～99.02%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.23%～4.48%?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)的要求（表1）。

表1 甲維鹽在煙葉和土壤中方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of emamectin benzoate method recovery in tobacco and soil

2.4 最佳操作條件的選擇

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇 由甲維鹽的紫外光譜圖可以看出，AVM-B1a和B1b的最大吸收波長(zhǎng)均在245 nm附近，由于流動(dòng)相在該波長(zhǎng)處無吸收且對(duì)B1a和B1b峰位置無干擾，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為245 nm（圖2）。通過幾種流動(dòng)相：甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水等不同比例的選擇，以保留時(shí)間適中、分離效果較好等因素最終確定為甲醇/水（88:12，V/V）作為該方法的流動(dòng)相[4]。

2.4.2 提取方法的選擇 比較不同提取方法勻漿法和振蕩法的提取效率，并比較不同提取溶劑體系丙酮/水、乙腈/水和甲醇/水的提取率。最終確定以振蕩法提取，將丙酮和水作為提取溶劑，比例為(1∶1，V/V)，提取率為 90%以上，明顯高于其他幾種方法，且振蕩法提取的雜質(zhì)較勻漿法少，以 1∶1比例的丙酮/水提取后再以 10%氯化鈉溶液和二氯甲烷萃取，能更好的避免將色素、焦油及水溶性雜質(zhì)提取出來，使提取液更潔凈，無較大干擾峰。樣品圖譜（圖3～4）。

2.4.3 SPE柱凈化效果的選擇 固相萃取(Solid phase Extraction SPE)[13]，是一種試樣預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，近年來得到了快速的發(fā)展，原理是利用組分與吸附劑固定相間選擇性吸附與選擇性洗脫的過程，達(dá)到提取分離、凈化和富集的目的，在樣品處理中也愈來愈多地被使用。凈化過程選擇SPE柱的種類尤為重要，它直接關(guān)系到方法的回收率。目前常用的SPE柱主要包括C18-SPE柱[11]、florisil-SPE柱和堿性氧化鋁SPE柱[13]。張啟迪等[13]比較了Waters sep-pak Vac 12cc-(2g)堿性氧化鋁SPE柱和C18-SPE柱在殘留檢測(cè)中的凈化效果，經(jīng)柱凈化的樣品，雜質(zhì)峰較多且對(duì)甲維鹽有干擾。經(jīng)多次調(diào)整流動(dòng)相比例及洗滌、洗脫的乙腈比例，但結(jié)果都不理想。本試驗(yàn)采用florisil-SPE柱經(jīng)過不同配比丙酮/二氯甲烷淋洗，采用1∶9、2∶8、4∶6、6∶4配比淋洗，以丙酮/二氯甲烷（6:4，V/V）淋洗，取得較理想回收率（表2）。

表2 florisil-SPE柱中不同配比溶劑淋洗試驗(yàn)Table2 Elution experiment of different proportion of solvent with florisil-SPE columns

圖2 甲維鹽標(biāo)樣Fig.2 AVM Standard sample

圖3 煙葉-對(duì)照、添加樣品Fig.3 Tobacco CK and tobacco spiked sample

圖4 土壤-對(duì)照、添加樣品Fig.4 Soil CK and soil spiked sample

3 討 論

由于該藥的廣泛使用，而且甲維鹽使用劑量小，分子量大，缺乏顯著的分析基團(tuán)，其殘留分析過程比較復(fù)雜。十幾年來，人們從分離和檢測(cè)兩方面對(duì)其殘留分析方法進(jìn)行了深入探索。由于該藥分子量大（B1a 873.11，B1b 859.08），GC、GC-MS均無法檢出，GB19337—2003[14]給出了用 HPLC-紫外檢測(cè)器檢測(cè)阿維菌素原藥和乳油的方法，但直接用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)限過高，不適用于進(jìn)行低殘留的樣品檢測(cè)。國際貿(mào)易中對(duì)其殘留指標(biāo)的檢測(cè)也十分重視，各國制訂了相當(dāng)嚴(yán)格的MRL值，美國、歐盟、食品法典委員會(huì)（CAC）和中國均制定了阿維菌素在作物中的最高殘留限量（MRL）。我國制定阿維菌素在葉菜類中的 MRL為0.05mg/kg[15]。但未制定煙草中 MRL標(biāo)準(zhǔn)，目前FAO/WHO也未對(duì)煙草中甲維鹽最大殘留限量（MRL）作出規(guī)定。本方法的各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，采用丙酮/水提取，F(xiàn)lorisil-SPE柱凈化，液相色譜紫外檢測(cè)器(UVD)測(cè)定，方法的最低檢出限為2.0×10-10g（B1a）；1.0×10-9g（B1b）；最低檢出濃度干煙葉中B1a為0.005 mg/kg、B1b為0.02 mg/kg，均能夠滿足煙草中甲維鹽殘留量的檢測(cè)。

[1]劉長(zhǎng)令.國外農(nóng)藥品種手冊(cè)：增補(bǔ)本[M].全國農(nóng)藥信息站，2000：101-102.

[2]河北威遠(yuǎn)生物化工股份公司.新農(nóng)藥介紹[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2001，22（1）：47.

[3]畢富春，徐鳳波.甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽研究概述[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2002，23（3）：31-33.

[4]李再興，宋存義，楊景亮，等.高效液相色譜法測(cè)定廢水中阿維菌素的含量[J].中國環(huán)境監(jiān)測(cè)，2007，23（3）：7-9.

[5]高國文.高效液相色譜法檢測(cè)大白菜中阿維菌素殘留量[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2005，26（11）：8-9，25.

[6]李晶，董豐收，劉新剛，等.高效液相色譜檢測(cè)梨中阿維菌素殘留方法研究[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2008，29（2）：18-22.

[7]康占海，李星，龐民好，等.2%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑的高效液相色譜分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（32）：10206，10241.

[8]趙領(lǐng)軍，張麗軍.冬棗中阿維菌素殘留的熒光法檢測(cè)試驗(yàn)[J].河北果樹，2007（5）：6-7.

[9]潘保良，汪明，王玉萬，等.綿羊血漿阿維菌素?zé)晒飧咝б合嗌V檢測(cè)的建立[J].中國獸醫(yī)科技，2002，32（11）：8-11.

[10]孫明娜，萬宇，朱傳明，等.液相色譜—熒光法測(cè)定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在甘藍(lán)和土壤中的殘留[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（18）：7533-7534.

[11]董靜，宮小明，張立，等.QUECHES—高效液相色譜法檢測(cè)蔬菜中的吡蟲啉、蟲酰肼、阿維菌素和噻螨酮[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2008（3）：91-94.

[12]劉群，盧芳，曾勇，等.紫外分光光度測(cè)定阿維菌素預(yù)混劑的含量[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2002（1）：19-20.

[13]張啟迪，鄒明，劉文華，等.阿維菌素殘留檢測(cè)中不同SPE柱凈化效果的比較研究[J].中國動(dòng)物檢疫，2007，24（12）：29-30.

[14]全國標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).GB19337—2003 阿維菌素原藥乳油檢測(cè)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004：1-7.

[15]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所 農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)匯編[G].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：8-113.