馬建華，鄭繪霞，趙玉澤，趙正保

（1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化教研室，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，山西太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)兒科系，山西太原 030001）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統(tǒng)在UC腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過(guò)程中始終發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程，腸道黏膜免疫系統(tǒng)中促炎性細(xì)胞因子與抗感染細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所致的免疫異常是UC的重要發(fā)病機(jī)制[1]，而促炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-α是公認(rèn)的能介導(dǎo)UC發(fā)病的細(xì)胞因子[2-3]。另外，UC腸黏膜炎癥導(dǎo)致的損傷可能是活性氧的作用結(jié)果[4]，有研究認(rèn)為抗感染作用的主要機(jī)制是抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化治療如應(yīng)用SOD或增強(qiáng)SOD活性均能有效防治結(jié)腸黏膜損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察新藥腸必清栓[6]對(duì)UC模型大鼠腸組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、抗氧化反應(yīng)的酶SOD表達(dá)的影響，從細(xì)胞因子角度進(jìn)一步探討其治療UC的免疫學(xué)機(jī)制和抗感染、抗氧化的作用機(jī)制，為腸必清栓治療UC提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康 SD大鼠 54只，雌雄各半，體重（200±20）g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；柳氮磺吡啶原料由山西三九同達(dá)藥業(yè)有限公司提供；腸必清栓由本實(shí)驗(yàn)室自制；IL-1（批號(hào)：BA0962200905）、SOD 抗體（批號(hào)：BA1401200905），SABC 免疫組化檢測(cè)試劑（批號(hào)：SA2002200905）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TNF-α 抗體（批號(hào)：J1608200904）、PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑（批號(hào)：K96712E200904）購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UC模型的建立及分組治療 用2,4-二硝基氯苯免疫加醋酸局部灌腸法造模后將48只大鼠隨機(jī)分為五組：模型對(duì)照組（A 組，8 只），腸必清栓低、中、高劑量組（B、C、D組，各 10 只），柳氮磺吡啶（SASP）藥物對(duì)照組（E 組，10 只），另設(shè)正常對(duì)照組（F組，6只）。A、F組給予等量的不含藥物的空白基質(zhì)，B、C、D 組分別按 160、320、640 mg/（kg·次）給藥，E組按300 mg/（kg·次）給藥，1次/d。給藥2周后將實(shí)驗(yàn)大鼠全部處死取結(jié)腸組織，中性福爾馬林固定，病理切片做免疫組化染色。

1.2.2 細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、SOD檢測(cè) 采用免疫組化法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作， 其中一抗?jié)舛确謩e為1∶100、1∶100、1∶200。染色結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。IL-1β、SOD采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，在400倍視野下選取5個(gè)陽(yáng)性顆粒清晰、無(wú)非特異性染色的視野，測(cè)定其灰度值；TNF-α參照Fromowitz半定量法計(jì)分[7]，陽(yáng)性細(xì)胞率<0.05為0分，0.05～0.25為1分，0.26～0.50為2分，0.51～0.75為3分，>0.75為4分；胞質(zhì)染色陰性為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將前兩個(gè)分?jǐn)?shù)相加，每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分后取其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。評(píng)分?jǐn)?shù)值應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

腸必清栓對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表達(dá)的影響：模型組和給藥組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、SOD呈彌散性分布，在黏膜上皮均有表達(dá)，主要分布于黏膜腺體內(nèi)及間質(zhì)炎性細(xì)胞胞質(zhì)；TNF-α在黏膜層間質(zhì)表達(dá)，圍繞炎性細(xì)胞核呈團(tuán)塊狀的胞質(zhì)表達(dá)，模型組見(jiàn)少量胞核著色。模型組大鼠腸組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著增多（P<0.01），而SOD顯著減少（P<0.01），給藥治療可明顯降低IL-1β、TNF-α的表達(dá)；腸必清栓低、中、高劑量組間呈劑量依賴關(guān)系，且三組間差異顯著，高劑量組與柳氮磺吡啶藥物對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SOD在模型大鼠腸組織中僅少量表達(dá)，給藥治療可提高模型大鼠SOD的表達(dá)，腸必清栓中、高劑量組、柳氮磺吡啶藥物對(duì)照組和正常組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

3 討論

UC腸道炎癥與黏膜免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子的失衡和抗氧化系統(tǒng)的失衡有關(guān)。細(xì)胞因子失衡表現(xiàn)為炎性細(xì)胞因子異常增多而抑炎性細(xì)胞因子異常減少或相對(duì)不足[8-9]。因此，近幾年細(xì)胞因子成為UC發(fā)病與治療研究中的熱點(diǎn)，其中促炎性因子，如 IL-1、TNF-α、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 等，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，與炎癥有關(guān)；抗炎性細(xì)胞因子主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，如 IL-10、白介素-1 受體拮抗劑（IL-1ra）、IL-4、IL-11、IL-13等，參與體液免疫反應(yīng)，在維持機(jī)體正常免疫系統(tǒng)中起重要作用[10-11]。研究認(rèn)為，UC中導(dǎo)致組織損傷的急性炎癥很大程度上是由TNF-α和IL-1β的強(qiáng)大生物活性造成的[2-3]。

表1 腸必清栓對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表達(dá)的影響（）Tab.1 Effects of Changbiqing Suppository on the expression of IL-1β，TNF-α and SOD in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis()

表1 腸必清栓對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表達(dá)的影響（）Tab.1 Effects of Changbiqing Suppository on the expression of IL-1β，TNF-α and SOD in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis()

與模型對(duì)照組比較，a P<0.01；與正常對(duì)照組比較，b P<0.01；與腸必清栓低劑量組比較，c P<0.01；與腸必清栓中劑量組比較，d P<0.01Compared with UC model group,a P<0.01;compared with normal control group,b P<0.01;compared with Changbiqing Suppository low dose intervention group,c P<0.01;compared with Changbiqing Suppository moderate dose intervention group,d P<0.01

組別n IL-1βTNF-αSOD模型對(duì)照組857.478±4.8005.7±0.1137.430±12.600腸必清栓低劑量組1070.345±6.700ab 4.5±0.2ab 99.915±8.100a腸必清栓中劑量組1097.914±7.500abc 2.8±0.5abc 78.573±6.200ac腸必清栓高劑量組10112.910±10.800abcd 2.3±0.2abcd 77.873±7.000ac柳氮磺吡啶藥物對(duì)照組10116.770±13.500abcd 2.3±0.2abcd 75.868±6.600ac正常對(duì)照組6141.070±21.300a 1.5±0.2a 77.109±4.200ac

IL-1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥介質(zhì)，它促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，分泌細(xì)胞因子，參與輔助抗原提呈細(xì)胞（APC）激活Th細(xì)胞，增強(qiáng)CTL的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用，引起巨噬細(xì)胞趨化和合成 IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2等；能誘導(dǎo)下丘腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜磷脂釋放花生四烯酸，還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中環(huán)氧化酶（cyclooxygenases）基因表達(dá)，促進(jìn)骨髓釋放中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞和多核粒細(xì)胞趨化浸潤(rùn)到炎癥局部，在局部釋放溶酶體酶，還可引起嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)等[12-13]。

TNF-α主要是由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其生物學(xué)活性非常復(fù)雜，參與免疫和炎癥的調(diào)節(jié)；可誘導(dǎo)IL-1增加，與IL-2協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫應(yīng)答的能力和殺傷功能，對(duì)炎癥局部的中性粒細(xì)胞的活性和聚集也有促進(jìn)作用，抑制B細(xì)胞增殖和分泌免疫球蛋白，可活化 NF-κB，誘導(dǎo) IL-1、IL-6、IL-8 和 TNF 等基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9,11,13-14]。

近年來(lái)一些研究認(rèn)為機(jī)體氧自由基（oxygen free radical，OFR）的形成和抗氧化系統(tǒng)的失衡在UC發(fā)病過(guò)程中起重要作用[14-15]。劉穎等[15]報(bào)道UC患者結(jié)腸黏膜中自由基水平明顯升高，抗氧化系統(tǒng)存在缺陷；鄧?yán)虻萚16]用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)大鼠UC模型，潘洋等[17]采用二硝基氯苯和乙酸復(fù)合方法制備大鼠UC模型，均觀察到大鼠結(jié)腸組織中MDA含量顯著升高，SOD活性明顯下降。這些結(jié)果與研究的理論一致，進(jìn)一步印證了UC患者及模型大鼠結(jié)腸黏膜中自由基水平升高而抗氧化系統(tǒng)存在缺陷。SOD和GSH-Px是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑。UC患者及模型大鼠腸組織中自由基的大量存在及抗氧化系統(tǒng)缺陷如SOD活性下降等，是造成自身組織損傷的關(guān)鍵，若用抗氧化治療，清除自由基或提高機(jī)體抗氧化酶的活性，能有效防止結(jié)腸黏膜損傷；而且，抗氧化劑包括N-乙酰半胱氨酸、SOD、過(guò)氧化氫酶、維生素E等可以抑制NF-κB的活化[18]，從而間接抑制了由NF-κB轉(zhuǎn)錄的大量炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF的產(chǎn)生，最終起到減輕炎癥、保護(hù)自身組織損傷的作用。

UC的發(fā)病是多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的結(jié)果，而細(xì)胞因子的作用并不是孤立的，是相互正負(fù)調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。本實(shí)驗(yàn)中，腸必清栓可顯著降低UC模型大鼠腸組織中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，而上調(diào)SOD的表達(dá)。通過(guò)抑制 IL-1β、TNF-α 的表達(dá)， 從而抑制 IL-1β、TNF-α 誘生的IFN-α/β、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 等多種炎性 CK 的生成，抑制TNF-α還能阻斷由TNF-α介導(dǎo)的NF-κB的活化，從轉(zhuǎn)錄水平減少炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12 等的表達(dá)，由此形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)；而SOD活性增強(qiáng)又可進(jìn)一步抑制炎癥及損傷，從而影響細(xì)胞因子相互正性或負(fù)性調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)。腸必清栓下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、增強(qiáng)組織中SOD的活性，在治療UC中發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)及抗感染、抗氧化作用。

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