趙 華， 張慧明，， 董銀卯， 都曉偉， 何聰芬， 邳 楠

(1. 北京工商大學(xué) 北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(ginkgobiloba)的干燥葉，其主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯類(lèi)化合物[1]. 銀杏黃酮能清除超氧陰離子及羥自由基，降低血漿過(guò)氧化脂質(zhì)和紅細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)含量，具有抑制大鼠紅細(xì)胞溶血及大鼠肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，因而在藥品、保健食品和化妝品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2-4]. 銀杏黃酮常用的提取方法有煎煮、冷浸、回流、滲漉等，不同提取方法得到的產(chǎn)率有一定差異[5]. 常用的提取溶劑是乙醇、丙酮和甲醇等有機(jī)溶劑. 由于甲醇、丙酮等毒性較大，因此一般采用乙醇作為浸取劑. 乙醇作為提取溶劑具有選擇性高、滲透性強(qiáng)、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，但乙醇蒸氣壓高、易燃易爆，而且生產(chǎn)成本較高，所以也有其局限性[6]. 黃酮類(lèi)化合物在水中具有一定的溶解度，故采用水浸取亦可分離銀杏葉有效成分，且水浸成本低，產(chǎn)品安全，無(wú)環(huán)境污染. 從成本和效益方面考慮，在保證較高提取率的前提下，選用廉價(jià)溶劑和簡(jiǎn)單的提取工藝，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義[7].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器

HHS21-8型恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV2300型紫外分光光度計(jì)；植物樣本粉碎機(jī)；CP224S電子天平.

1.1.2試劑

蘆?。簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等均為分析純，北京化工廠(chǎng)；銀杏葉：采集.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[8-9]

1.2.1銀杏葉總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程的建立：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.055 g，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶解，定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度ρ為0.55 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液. 精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1，2，3，4，5 mL于6 個(gè)50 mL容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)至25 mL，加入1.4 mL 5% NaNO2搖勻，放置5 min后加入1.4 mL10% Al(NO3)3，6min后再加入1 mol/L NaOH 10 mL，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度. 于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值，參比為空白試劑.

提取率=(c×d×v)/m×100%.

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出的樣品的黃酮濃度，mg/mL；v為樣品溶液的體積，mL；d為樣品的總稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量，mg.

1.2.2料液比對(duì)銀杏葉總黃酮提取率影響的實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取5份銀杏葉，每份2g，粉碎后過(guò)20目篩，分別放入5個(gè)三角燒瓶中，依次加入去離子水，組成料液比W(g)∶V(mL)(下同)分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶40的混合液，攪拌均勻后浸提，以浸提后溶液中總黃酮提取率為標(biāo)準(zhǔn)考察料液比對(duì)黃酮提取率的影響.

1.2.3提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取率影響的實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取5份銀杏葉，每份2 g，粉碎后過(guò)20目篩，分別放入5個(gè)三角燒瓶中，加入30 mL去離子水，攪拌均勻后90 ℃浸提，浸提時(shí)間依次為2，3，4，5，6 h，以浸提后溶液中總黃酮提取率為標(biāo)準(zhǔn)考察浸提時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響.

1.2.4提取溫度對(duì)銀杏總黃酮提取率影響的實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取5份銀杏葉，每份2 g，粉碎后過(guò)20目篩，分別放入5個(gè)三角燒瓶中，加入30 mL去離子水，攪拌均勻后分別放入50，70，80，90，100 ℃水浴中浸提，以浸提后溶液中總黃酮提取率為標(biāo)準(zhǔn)考察浸提溫度對(duì)黃酮提取率的影響.

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法(RSD)對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化

銀杏葉黃酮提取條件優(yōu)化根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)影響結(jié)果，選取提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、料液比(X3)對(duì)銀杏葉黃酮提取率影響顯著的3個(gè)因素. 在確定提取1次的情況下，采用3因素3水平響應(yīng)面分析方法，分析因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 部分因子設(shè)計(jì)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of fractional fractorial design

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度(x)與吸光度(y)進(jìn)行直線(xiàn)回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1. 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y= 0.009 3x+ 0.095 1.R2= 0.998 3.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 料液比對(duì)銀杏總黃酮提取率的影響

提取溫度和提取時(shí)間一定時(shí)，銀杏總黃酮提取率隨料液比的變化如圖2. 可以看出，在相同提取溫度、提取時(shí)間條件下，隨著料液比的不斷升高，黃酮類(lèi)化合物的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但1∶15后上升趨勢(shì)不明顯，擴(kuò)大料液比對(duì)浸提效果影響不大，為減少投入，宜選擇1∶15為好.

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of the solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

2.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏總黃酮提取率的影響

在提取溫度和料液比一定時(shí)，銀杏總黃酮提取率隨提取時(shí)間的變化如圖3. 可以看出提取液中黃酮提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，提取2 h時(shí)總黃酮提取率為4.87%，提取6 h時(shí)黃酮提取率可達(dá)6.21%.

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction rate of flavonoids

2.4 提取溫度對(duì)銀杏總黃酮提取率的影響

在提取時(shí)間和料液比一定時(shí)，銀杏總黃酮提取率隨提取溫度的變化如圖4. 可以看出提取液中黃酮提取率隨提取溫度的升高而不斷增大，當(dāng)溫度為90℃時(shí)達(dá)到最高，100℃時(shí)考慮可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致活性成分被破壞而使提取率下降.

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of flavonoids

2.5 銀杏葉黃酮類(lèi)化合物水提工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.5.1銀杏葉總黃酮提取條件優(yōu)化

15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為兩類(lèi)，一類(lèi)為析因點(diǎn)，自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12 個(gè)析因點(diǎn)；另一類(lèi)為零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3 次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。具體響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 銀杏葉黃酮類(lèi)化合物水提工藝設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Tab.2 Design and results of Ginkgo flavonoids water extraction

由響應(yīng)面軟件SAS(statistical analysis system)8.0得到的分析結(jié)果可知：模型的決定系數(shù)R2=92.41%，說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，使用該方程模擬真實(shí)的3因子3水平的分析是可行的.

回歸方程方差分析如表3. 當(dāng)“Pr>F”值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，當(dāng)“Pr>F”值小于0.001則表示該項(xiàng)指標(biāo)極其顯著. 由分析結(jié)果來(lái)看，提取時(shí)間的影響最大(0.016 656)，達(dá)到顯著水平，其次為料液比(0.042 499)、提取溫度(0.443 473)指標(biāo)不顯著. 各平方項(xiàng)和提取溫度與料液比的交互項(xiàng)也對(duì)銀杏葉總黃酮的提取率有影響. 響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7.

表3 銀杏葉黃酮類(lèi)化合物水提工藝的響應(yīng)面AVON分析結(jié)果Tab.3 AVON response surface analysis of Ginkgo flavonoids water extraction

圖5～圖7直觀(guān)地反映了各因素交互作用對(duì)響

X3=0圖5 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面與等值線(xiàn)Fig.5 Response surface plot for effects of extraction temperature and extraction times on extraction rate of total flavonoids

X2=0圖6 提取溫度和料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面與等值線(xiàn)Fig.6 Response surface plot for effects of extraction temperature and olid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

應(yīng)值的影響. 比較3組圖及數(shù)據(jù)可知，提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡；而料液比與提取時(shí)間次之，相應(yīng)表現(xiàn)為曲線(xiàn)較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小.

2.5.2方程的最優(yōu)解及最佳條件

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行SAS三元非線(xiàn)性回歸分析，可得如下回歸方程：

Y1=6.423 667+0.161*X1+0.684 25*X2-
0.523 75*X3-0.660 083*X1*X1+
0.174 5*X1*X2-0.657 5*X1*X3-
0.534 583*X2*X2-0.013 5*X2*X3-
1.527 583*X3*X3.

應(yīng)用SAS運(yùn)算得出最佳工藝條件為：提取溫度93.37 ℃，提取時(shí)間3.7 h，料液比1∶13.76. 預(yù)測(cè)黃酮提取率最大值6.754%.

2.5.3銀杏葉黃酮類(lèi)化合物水提工藝最佳條件的驗(yàn)證

取2 g干燥的銀杏葉粉放入50 mL三角瓶中，在最佳提取條件料液比1∶13.76，T=93 ℃，提取時(shí)間3.7 h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次取平均值，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.

X1=0圖7 提取時(shí)間和料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面與等值線(xiàn)Fig.7 Response surface plot for effects of extraction time and olid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

編號(hào)黃酮提取率/%平均提取率/%16.75126.7496.74936.746

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化銀杏葉活性成分總黃酮的提取. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間、料液比和提取溫度與料液比交互項(xiàng)對(duì)總黃酮提取率的影響顯著. 說(shuō)明提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系. 回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法合理可行. 得到總黃酮提取的最佳條件為：提取溫度93.37 ℃，提取時(shí)間3.70 h，料液比1∶13.76，提取1次，銀杏葉總黃酮實(shí)際提取率達(dá)6.749%，比文獻(xiàn)報(bào)道的銀杏葉總黃酮水浸提取率提高了1.859%[10]. 利用響應(yīng)面分析法得到的銀杏葉總黃酮提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，在保證提取率的前提下，簡(jiǎn)化了工藝，降低了成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

目前人們?cè)阢y杏黃酮的活性機(jī)理、吸收及代謝機(jī)制、穩(wěn)定性等方面仍缺乏全面的認(rèn)識(shí)，因此應(yīng)加強(qiáng)此方面的研究工作，弄清其生理功能從而進(jìn)行更有效的分離和提取，為銀杏葉黃酮在藥品、保健食品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，加速植物資源的科學(xué)利用.