徐 虹， 青山賴孝， 宋煥祿

(1.北京工商大學 化學與環(huán)境工程學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心， 北京 100048； 2.日本名古屋文理大學 健康生活學部， 日本愛知縣 492-8520)

D-青霉胺是一種含巰基氨基酸，具有螯合金屬離子的能力，尤其是銅離子. 它能有效地去除體內(nèi)多余的銅離子而被用于人類Wilson病——一種遺傳性的異常銅代謝疾病的治療[1-2]. D-青霉胺也能很好地用于緩解肝臟中銅異常積聚的LEC大鼠的肝炎癥狀[3-4]. 目前對于D-青霉胺藥性研究的動物試驗常用方法是將D-青霉胺溶解于去離子水中，以每天10 mg/100 g體重的劑量喂飼[3-10]. 然而，強迫實驗動物每天飲用D-青霉胺口服液并不容易. 因此，本實驗將口服D-青霉胺混合在膳食成分中讓實驗大鼠通過攝食自然攝取，旨在尋求一種更為簡便和人道的治療途徑，并探討其有效移除大鼠體內(nèi)銅離子的最適膳食劑量. 同時，本實驗還比較了銅和鋅這兩種微量元素在體內(nèi)的代謝途徑.

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及給藥

本實驗嚴格遵守日本實驗動物管理委員會制定的實驗動物管理條例. SPF級Fischer大鼠42只，雄性，體重(99±2) g，購自日本靜岡濱松市SLC株式會社，分別單獨飼養(yǎng)于不銹鋼鼠籠. 動物房始終保持23 ℃左右以及12 h循環(huán)光照(每天早8：00亮燈，晚8：00熄燈). 實驗開始的前3 d，所有大鼠自由攝取空白膳食和飲用普通水以適應新環(huán)境. 三天后，42只大鼠根據(jù)體重被分成7組(每組6只)并被分別喂飼空白膳食或添加質(zhì)量濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，1.0% D-青霉胺的膳食組和去離子水. 實驗膳食配方如表1. 整個飼養(yǎng)期間，每日測量每只大鼠的體重和攝食量. 并于實驗第7至9 d用代謝籠收集72 h尿液. 16 d實驗期結(jié)束后，大鼠被斷頭宰殺并取血樣. 肝臟被迅速移取、稱重并入液氮冷凍. 血樣經(jīng)3 000×g速度離心后移取血清樣品. 最后所有肝臟和血清樣品儲藏于-80 ℃冷柜至各項生化指標測定分析.

1.2 金屬含量及生化指標測定

1.2.1 銅與鋅含量的測定

肝臟、血清及尿液中的銅鋅含量由原子吸收分光光度計測定. 血清和尿液樣品可直接測定，肝臟樣品測定前取等量的份先用濃硝酸濕法灰化，然后用30%的過氧化氫徹底消化[11].

1.2.2 脂質(zhì)的測定

肝臟和血清中的三酰甘油[12]、膽固醇[13]以及血清中的磷脂[14]含量分別用酶法測定. 肝總脂肪按Folch等所采用的方法提取和純化[15]后用重量法測得. 然后，肝臟中的磷脂含量以[總脂肪含量-(三a表示購自新西蘭威靈頓新西蘭奶制品公司；b表示購自德國Sigma化學制劑公司；c表示購自日本大阪和光純藥工業(yè)株氏會社；d表示已糊化，購自日本愛知縣中央食糧株氏會社.

表1 實驗膳食配方

酰甘油含量+膽固醇含量)]差值計算獲得. 最后，分別以885.4(三酰甘油中主要成分三油酸甘油酯的分子量)和786.1(磷脂中主要成分L-α-磷脂酰膽堿的分子量)作為三酰甘油和磷脂的分子量計算它們的摩爾濃度.

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠的生長指標測定

測定不同膳食組的大鼠生長指標，結(jié)果見表2. 由表2可以看出，0.1%，0.2%，0.3%和0.4%D-青霉胺組大鼠的攝食量和體重增長量與空白組的大鼠相比沒有顯著性差異，而0.5%D-青霉胺膳食組大鼠的攝食量和體重增長量比空白組明顯降低，1.0%D-青霉胺膳食組則顯著低于0.5%D-青霉胺膳食組. 但就鮮肝重而言，不同處理之間并沒有明顯差異.

表2 大鼠生長指標測定

注：a,b,c表示在同一縱向組中，帶有不同角標字母的測定結(jié)果之間有顯著差異(P<0.05).(下同)

2.2 大鼠肝臟中銅鋅含量

測定不同膳食組的大鼠肝臟中銅鋅含量，結(jié)果見表3. 由表3可知，0.1%，0.2%D-青霉胺膳食組的肝銅含量和空白組之間沒有顯著區(qū)別. 自從0.3%劑量開始，肝銅含量隨著D-青霉胺的膳食劑量增高而顯著遞減，但在0.4%和0.5%D-青霉胺兩組之間沒有顯著區(qū)別. 然而，實驗組大鼠的肝鋅含量卻始終和空白組保持同一水平，并沒有隨劑量變化而變化.

2.3 尿液中銅鋅含量

處理72 h后大鼠尿銅和鋅含量在0.1%，0.2%D-青霉胺膳食組和空白組之間沒有區(qū)別，見表4. 但自從0.3%劑量開始，尿銅含量顯著增加，尤其是0.5%劑量時尿銅的排泄在各實驗組達最高水平，1.0%D-青霉胺膳食組則低于0.5%實驗組. 尿鋅的排泄從0.3%劑量開始隨劑量的增高而增高，在1.0%劑量時達最高水平.

表3 大鼠肝臟中銅鋅含量

表4 大鼠尿液中銅鋅含量

2.4 大鼠血清中銅鋅含量

測定不同膳食組大鼠血清中銅鋅含量，結(jié)果見表5. 由表5可以看出，血清銅和鋅含量在0.1%，0.2%D-青霉胺組和空白組之間沒有區(qū)別. 從0.3%劑量開始，血清中銅含量隨著D-青霉胺的膳食劑量增高而顯著遞減，和肝銅的變化趨勢一致. 血清中鋅含量從0.2%劑量開始隨劑量的增加而降低，至0.5%劑量水平血清中鋅含量最低，但在1.0%劑量組和0.5%劑量組之間并沒有顯著區(qū)別.

表5 大鼠血清中銅鋅含量

2.5 大鼠肝臟中脂肪含量

測定不同膳食組大鼠肝臟中脂肪含量，結(jié)果見表6. 由表6可知，各水平D-青霉胺的喂食沒有影響大鼠肝臟中三酰甘油和膽固醇的含量，僅有1.0%劑量的D-青霉胺輕度降低了大鼠肝臟中磷脂的含量.

表6 大鼠肝臟中脂肪含量

2.6 大鼠血清中脂肪含量

測定不同膳食組大鼠血清中脂肪含量，結(jié)果見表7. 由表7可以看出，各水平D-青霉胺的喂食沒有影響大鼠血清中磷脂和膽固醇的含量，但是0.5%和1.0%劑量的D-青霉胺不同程度地降低了血清中三酰甘油的含量.

表7 大鼠血清中脂肪含量

3 討論與結(jié)論

在本實驗中，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%和1.0%六個不同水平的D-青霉胺膳食劑量被選擇作為實驗劑量. 按這些大鼠平均每日的攝食量為9.1 g/100 g體重計算，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%和1.0%各D-青霉胺膳食組的大鼠相當于每日攝入D-青霉胺的量分別為9.1 mg/100 g 體重、18.2 mg/100 g 體重、27.3 mg/100 g 體重、36.4 mg/100 g 體重、45.5 mg/100 g 體重和91.0 mg/100 g體重.

0.1%膳食組大鼠每日的D-青霉胺攝入量略低于常用的口服液劑量10 mg/100 g體重，而0.2%膳食組的大鼠每日D-青霉胺的攝入量則約為常用口服液劑量的1.8倍. 但是從實驗結(jié)果可知，無論喂飼0.1%還是0.2%的實驗膳食均沒有對大鼠的食物攝入量、體重的增長、體內(nèi)銅鋅和脂肪水平造成任何影響. 0.3%和0.4%膳食劑量也沒有影響大鼠的成長和體內(nèi)脂肪代謝. 但是這兩個劑量卻把尿銅的排泄大幅度提高到空白組大鼠的3倍左右(表4)，這個效果與LEC大鼠飲用10 mg/100 g體重D-青霉胺口服液一周的效果相當[3-4]. 隨即，這兩組大鼠的肝臟和血清中銅含量也顯著下降(表3和表5). 當喂飼0.5%和1.0%膳食劑量時，體內(nèi)的銅通過尿的排泄分別被提高到空白組大鼠的4.9和4.2倍(表4)，顯著地減少了肝臟和血清中的銅含量(表3和表5). 但同時，0.5%和1.0%膳食劑量也明顯降低了實驗動物的食欲，抑制了它們的生長(表2)，不同程度地影響了體內(nèi)脂肪的代謝(表6和表7). 尤其是在實驗開始后，1.0%膳食劑量還引起了實驗大鼠的腹瀉癥狀(結(jié)果未列出).

綜上所述，D-青霉胺膳食由于其他膳食成分的混合影響了D-青霉胺的吸收，致使低劑量(0.1%和0.2%)的實驗膳食沒有發(fā)揮效用；高劑量(0.5%和1.0%)實驗膳食雖然達到了理想的降低體內(nèi)銅含量的效果，但也引發(fā)了一些副作用；而中等劑量(0.3%和0.4%)實驗膳食不僅可以顯著地移除肝臟和血清中的銅元素，也沒有給實驗大鼠造成不良影響. 因此，雖然將口服D-青霉胺混合在膳食成分中所發(fā)揮的效力不及溶于水中明顯，但由于其他膳食成分掩飾了D-青霉胺的不良口感，在整個實驗過程中實驗動物始終自覺自愿地攝取實驗膳食，免除了強迫喂飼的痛苦，更為人道，仍不失為一種合理的治療途徑，而比較本實驗的結(jié)果，我們認為0.3%～0.4%是D-青霉胺最適的膳食劑量.

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，0.3%，0.4%，0.5%和1.0%D-青霉胺膳食組也激增了鋅在尿液中的排泄(表4)，并且也降低了血清中鋅的含量，但是和銅元素不同，肝臟的鋅含量卻沒有降低(表3). 這一發(fā)現(xiàn)和Aoyama等人[16]報道的當給大鼠喂飼過量組胺酸膳食所觀察到的體內(nèi)銅鋅含量變化是相似的. 由此可見，銅和鋅在大鼠體內(nèi)的代謝途徑并不完全一致，看起來似乎還有更微妙的機理控制著大鼠肝臟中的鋅含量.