周許峰,孫維君,張義平,曹 俊,王麗麗 殷嫦嫦

(九江學(xué)院醫(yī)學(xué)院生化教研室,江西九江 332000)

毫米波是指波長 1～10 mm的高能電磁波,用于治療高血壓、高血脂、心絞痛、冠心病、缺血性心臟病及各種血管炎癥療效較好且有累積效應(yīng)和遠(yuǎn)位效應(yīng)[1]。但有關(guān)毫米波輻照治療心血管疾病的不良反應(yīng)的研究很少,有關(guān)其對(duì)心肌成纖維細(xì)胞(CFbs)增殖和膠原合成功能影響的報(bào)道國內(nèi)外均未見。2008年 9月 ～2008年 11月,我們用波長 8.4mm的毫米波輻照 CFbs,觀察其增殖及膠原蛋白合成能力的變化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 CFbs,DMEM培養(yǎng)基,小牛血清,噻唑藍(lán)(MTT),二甲基亞砜(DMSO),羥脯氨酸檢測試劑盒,125IⅢ型膠原 N端肽放射免疫分析試劑盒(PCⅢNP RIA)。

1.2 方法

1.2.1 CFbs的培養(yǎng)分組及毫米波輻照方法 大鼠CFbs細(xì)胞懸液移入 25 ml培養(yǎng)瓶中,含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液在 37℃、5%CO2、濕度恒定的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3 d至融合態(tài)。0.25%胰蛋白酶消化傳代,每 3 d傳 1代。取第 3～10代細(xì)胞,隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組為對(duì)照組。 B、C、D組分別給予波長 8.4mm(頻率 35.75 GHz)、功率 10mW/cm2的毫米波輻照 15、30、60min,1次 /d,共 5 d。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性的檢測方法 用 MTT法檢測4組細(xì)胞輻照 2、5 d增殖活性。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。各組細(xì)胞增殖活性用各孔 490 nm波長下的吸光光度值(OD值)表示。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清羥脯氨酸(HYP)的檢測方法 采用 HYP堿水解法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測輻照 1、2、3、4、5 d各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清 HYP水平。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液上清Ⅲ型膠原氨基末端前肽(PⅢNP)的檢測方法 采用放射免疫分析法檢測輻照1、2、3、4、5 d各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清 PⅢNP水平。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以±s表示。組間比較采用配對(duì)和非配對(duì)資料t檢驗(yàn),兩組以上數(shù)據(jù)比較采用 ANOVA法,各因素間相關(guān)分析采用線性相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況 輻照 2、5 d各組細(xì)胞增殖活性見表 1。

2.2 培養(yǎng)液上清中 HYP水平 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 HYP水平見表 2。

2.3 培養(yǎng)液上清中 PⅢNP水平 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 PⅢNP水平見表 3。

表1 4組細(xì)胞輻照 2、5 d細(xì)胞增殖情況比較(±s)

表1 4組細(xì)胞輻照 2、5 d細(xì)胞增殖情況比較(±s)

注:與對(duì)照組相比,*P＜0.05;與C組相比,#P＜0.05;與輻照 2 d相比,△P＜0.05

組別 n 細(xì)胞增殖情況(OD值)輻照 2 d 輻照5 d A組 20 0.543±0.044 B組 20 0.549±0.038# 0.550±0.041 C組 20 0.576±0.032* 0.552±0.052△D組 20 0.593±0.039* 0.594±0.046*#

3 討論

心肌纖維化是指心肌 CFbs增殖及所分泌的間質(zhì)膠原纖維過度增生導(dǎo)致心肌組織的膠原濃度增加[2]。心肌纖維化導(dǎo)致心肌僵硬度異常,可導(dǎo)致難治性心衰及嚴(yán)重的心律失常[2]。心肌間質(zhì)膠原成分中Ⅰ型膠原約占 80%、Ⅲ型約 12%[3]。CFbs在離體培養(yǎng)的條件下,Ⅰ、Ⅲ型膠原以前膠原的形式釋放到培養(yǎng)基質(zhì)中[4]。前膠原蛋白中的脯氨酸經(jīng)過脯氨酸羥化酶的羥化作用生成 HYP,是前膠原蛋白轉(zhuǎn)變成膠原蛋白的關(guān)鍵步驟,HYP約占膠原氨基酸總量10%[5]。因此通過堿水解法測定培養(yǎng)上清中HYP,可以反映培養(yǎng)細(xì)胞膠原蛋白的合成量。Ⅲ型前膠原分子在氨基端和羧基端含有前肽序列,在合成成熟膠原時(shí),這些序列被特殊的內(nèi)肽酶切下,故理論上培養(yǎng)上清中前肽的數(shù)量可以反映膠原水平。由于 PⅢNP在形成膠原纖維時(shí)被不完全切下,有部分前肽仍連接在膠原纖維的表面,膠原降解時(shí) PⅢNP會(huì)從膠原表面釋放入血,故 PⅢNP不但可以反映Ⅲ型膠原合成水平,也可以反映Ⅲ型膠原的降解水平。血中 PⅢNP是一種較好的檢測心肌纖維化程度的指標(biāo)[6]。

表2 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 HYP水平比較(±s)

表2 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 HYP水平比較(±s)

注:與 A組相比,*P＜0.05;與 C組相比,#P＜0.05

組別 n HYP(μg/m l)輻照1 d 輻照2 d 輻照3 d 輻照4 d 輻照5 d A組 6 4.73±0.23 6.29±0.25 6.12±0.29 6.90±0.27 7.51±0.49 B組 6 5.52±0.31*# 6.32±0.28# 7.30±0.24*# 8.64±0.33*# 8.46±0.29*#C組 6 6.10±0.36* 6.89±0.24* 8.27±0.29* 9.23±0.35* 9.56±0.43*D組 6 7.47±0.33*# 7.68±0.30*# 9.61±0.52*# 9.99±0.50*# 10.49±0.58*#

表3 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 PⅢNP水平比較(±s)

表3 4組細(xì)胞輻照 1～5 d培養(yǎng)液上清 PⅢNP水平比較(±s)

注:與 A組相比,*P＜0.05;與 C組相比,#P＜0.05

組別 n HYP(μg/m l)輻照1 d 輻照2 d 輻照3 d 輻照4 d 輻照5 d A組 6 134.5±4.0 144.5±5.4 156.0±3.0 179.0±3.5 185.1±2.3 B組 6 188.5±4.3*# 188.2±5.0*# 206.8±5.6*# 219.5±4.2*# 227.7±5.6*#C組 6 211.7±5.0* 217.7±4.1* 230.5±5.5* 239.7±8.3* 258.8±4.4*D組 6 229.7±5.5*# 240.7±2.6*# 259.8±5.0*# 268.5±3.7*# 270.1±9.0*#

本研究結(jié)果顯示,毫米波輻照對(duì)大鼠 CFbs增殖有明顯影響,與 A組相比 B、C、D組 CFbs增殖活性均有不同程度升高,且隨照射次數(shù)和每日照射時(shí)間增加呈逐漸升高趨勢。細(xì)胞培養(yǎng)液上清中 HYP和PⅢNP水平均隨毫米波每次照射時(shí)間及照射天數(shù)增加而增加。表明低強(qiáng)度毫米波輻照可以促進(jìn)大鼠心肌 CFbs的增殖及膠原蛋白合成,可使心肌 CFbs加速增殖、膠原蛋白合成大量增加。用毫米波輻照治療高血壓、心肌梗塞、原發(fā)性心肌病、冠心病等心血管疾病時(shí),每次輻照時(shí)間、治療療程較長有導(dǎo)致心肌纖維化的可能性。

現(xiàn)有理論認(rèn)為,毫米波對(duì)生物體的效應(yīng)主要為非熱效應(yīng)。低強(qiáng)度毫米波(≤10mW/cm2)照射時(shí),生物體不會(huì)產(chǎn)生明顯的溫度升高,但其所產(chǎn)生的電磁波的頻率與人體組織細(xì)胞固有振蕩頻率接近,故可通過諧振作用傳入人體產(chǎn)生一系列場效應(yīng)、光化學(xué)反應(yīng)、電磁共振等能量和信息效應(yīng),引起人體組織內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)變化及其生化變化而達(dá)到治療效果,并具有頻率窗效應(yīng)、功率窗效應(yīng)、輻照時(shí)間累積效應(yīng)、遠(yuǎn)位效應(yīng)。多有研究認(rèn)為毫米波可對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生微弱的促生長作用,細(xì)胞染色質(zhì)中的 DNA可能是活細(xì)胞和毫米波之間的一個(gè)諧振作用靶。這也可能是本研究中毫米波輻照促進(jìn) CFbs中 DNA及膠原蛋白的合成的可能機(jī)制之一。

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