張 瑩 ，賈英杰，楊 潔 ，李小江

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，天津 300193）

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（multidrugresistance，MDR）是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種特殊的耐藥現(xiàn)象，是導(dǎo)致化療失敗的重要原因，并且也是肺癌化療緩解后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。當(dāng)前肺癌死亡率已經(jīng)居惡性腫瘤第1位[1]，由于鉑類藥物是肺癌聯(lián)合化療中的核心，且順鉑是當(dāng)前對肺癌患者單制劑化療及聯(lián)合化療效率較高的藥物之一，因此探討順鉑的多藥耐藥對肺癌化療具有相當(dāng)大的指導(dǎo)意義。本研究擬以耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP及其親代細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對象，探討消巖湯含藥血清對化療藥物多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，為腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)開辟嶄新的途徑。

1 材料

1.1 藥物 將消巖湯于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材1.5 g的藥液。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20.99±1.87）g。

1.3 瘤株 S180（腹水瘤）瘤株，由天津藥物研究所提供。

1.4 主要試劑與儀器 新生胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）、順鉑（錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，10 mg/瓶，批號：090601）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）、BB5060UVCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）、Model680酶聯(lián)免疫分析儀（Bio－RAD公司）等。

1.5 細(xì)胞系 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549：由天津市藥物研究所提供；耐順鉑（DDP）肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP：購自中國科學(xué)院腫瘤研究所。

2 方法

2.1 荷S180腫瘤小鼠模型制備：小白鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機(jī)數(shù)目表隨機(jī)分為高劑量組、低劑量組、模型空白對照組，共3組，每組20只。體外復(fù)蘇、培養(yǎng)S180細(xì)胞，在細(xì)胞的對數(shù)生長期收集細(xì)胞。用生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×109cell/L。每只小鼠右前腋下皮下接種0.2 mL[2]。

2.2 給藥方法與劑量：小鼠于接種S180腫瘤細(xì)胞24h后，高劑量組按消巖湯40 g/kg灌胃給藥；低劑量組按消巖湯20 g/kg灌胃給藥；模型空白對照組以0.4mL生理鹽水灌胃。每次灌胃間隔24h，連續(xù)10d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 小鼠生活狀況觀察 實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠的飲食、毛發(fā)、活動(dòng)、精神狀態(tài)等情況。

2.3.2 小鼠體質(zhì)量變化情況 于給藥前給每只小鼠稱質(zhì)量，于末次給藥后24 h再次稱質(zhì)量。記錄數(shù)據(jù)，分析。

2.3.3 腫瘤抑制率 小鼠末次給藥24 h后，用眼科剪分離完全剝?nèi)∧[瘤組織，剔凈周圍結(jié)締組織，電子天平稱質(zhì)量。計(jì)算抑瘤率。抑瘤率＝（模型空白對照組平均瘤質(zhì)量—給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型空白對照組平均瘤質(zhì)量×100%

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 參照劉文哲等人[3]介紹的方法并加以改進(jìn)。倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞長滿時(shí)，以1/10、1/20的細(xì)胞傳代，培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。

2.5 細(xì)胞懸液的制備 取對數(shù)生長期A549、A549/DDP細(xì)胞，加入適量的0.25%胰蛋白酶液消化，PBS洗滌2次，離心，棄上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成2×105/mL細(xì)胞懸液，用于實(shí)驗(yàn)。

2.6 MTT法檢測A549/DDP細(xì)胞的耐藥性 將兩株細(xì)胞的懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)2×103個(gè)。第一組為實(shí)驗(yàn)組，分別加入終濃度為10、20、40、80、100、200 μmol/L 的順鉑，終體積為 200 μL，每濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。第二組為陰性對照組，細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加藥物。第三組為空白調(diào)零組，僅加等體積的培養(yǎng)液。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔OD值，取每5個(gè)重復(fù)孔OD值的平均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，用Sigmaplot 10計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50），耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50值/敏感株IC50值。

2.7 MTT法檢測消巖湯含藥血清對A549及A549/DDP的細(xì)胞毒作用 參照詹茂程等人[4]的方法并加改進(jìn)，將細(xì)胞分為6組，用酶標(biāo)儀測OD550檢測各孔吸光度，用下列公式計(jì)算肺癌細(xì)胞在各種濃度下的細(xì)胞死亡率及耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 荷瘤小鼠生活狀況觀察 自5 d后空白模型對照組小鼠一般狀況變差，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、倦怠，毛發(fā)干澀，進(jìn)食減少，而同期的消巖湯高劑量組及低劑量組小鼠一般狀況明顯優(yōu)于空白模型對照組小鼠。

3.2 消巖湯對小鼠S180移植腫瘤生長的影響 3組在瘤質(zhì)量和去瘤后體質(zhì)量有顯著差異（P＜0.05）；高劑量組與低劑量組在瘤質(zhì)量與抑瘤率方面有顯著差異（P＜0.05）。說明消巖湯能對抗荷瘤小鼠體質(zhì)量減輕，并且能有效縮小荷瘤小鼠瘤體，其抑瘤作用與劑量成正相關(guān)。見表1。

表1 消巖湯對接種S180昆明小鼠抑瘤作用比較(±s)Tab.1 Comparison of inhibitive effects of Xiaoyan Tang-containing serum on tumor growth in KM mice(±s)

表1 消巖湯對接種S180昆明小鼠抑瘤作用比較(±s)Tab.1 Comparison of inhibitive effects of Xiaoyan Tang-containing serum on tumor growth in KM mice(±s)

注：*經(jīng)秩和檢驗(yàn)，三組比較，P<0.05；經(jīng)t檢驗(yàn)，低劑量組與高劑量組比較，P<0.05；**經(jīng)χ2檢驗(yàn)，高劑量組與低劑量組比較，P<0.05；***經(jīng)秩和檢驗(yàn)，三組比較，P>0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)高劑量組低劑量組模型空白對照組191817瘤質(zhì)量（g）*1.26±0.151.76±0.142.44±0.45抑瘤率（%）**48.3627.87-動(dòng)物體質(zhì)量（始）（g）***20.82±1.0520.66±2.3721.45±2.12動(dòng)物去瘤后體質(zhì)量（終）（g）*21.98±2.1919.85±3.4518.78±5.09體質(zhì)量變化（g）1.16-0.81-2.67

3.3 A549/DDP細(xì)胞耐藥性的鑒定 通過MTT法增殖動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)對A549/DDP細(xì)胞耐藥性進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果示A549及A549/DDP細(xì)胞對DDP 的 IC50值分別為 14.77 μmol/L，163.79 μmol/mL，耐藥倍數(shù)為11.09。證實(shí)此肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP相對于其親本細(xì)胞系A(chǔ)549，確實(shí)對傳統(tǒng)化療藥順鉑產(chǎn)生明顯的耐藥性，因此認(rèn)為該細(xì)胞是一株生長良好的耐藥系，適合用于后繼實(shí)驗(yàn)研究。

3.4 消巖湯含藥血清對A549及A549/DDP的細(xì)胞毒作用 當(dāng)消巖湯荷瘤動(dòng)物含藥血清高、低劑量組分別與DDP合用時(shí)，明顯提高了DDP對A549的殺傷作用；當(dāng)消巖湯荷瘤動(dòng)物含藥血清高、低劑量組分別與DDP合用時(shí)，對耐藥細(xì)胞A549/DDP的殺傷作用更加明顯，且能增強(qiáng)DDP對肺癌敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的殺傷作用，具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果見表2。

表2 消巖湯含藥血清對A549及A549/DDP的細(xì)胞毒作用比較Tab.1 Comparison of cyto-toxicity of Xiaoyan Tang-containing serum on the A549 and A549/DDP

4 討論

為解決腫瘤多藥耐藥的問題，許多學(xué)者致力于尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑，如tariquidar XR9576等，但這類藥物毒副作用明顯，效果不理想，目前還沒有一種藥物或方法在臨床被廣泛接受。因此，筆者試圖從中草藥中尋求復(fù)方以逆轉(zhuǎn)MDR。

消巖湯是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中醫(yī)腫瘤治則基礎(chǔ)上依據(jù)現(xiàn)代藥理研究研制出的院內(nèi)制劑，具有多種抗腫瘤活性，在臨床應(yīng)用10余年。經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)，消巖湯治療非小細(xì)胞肺癌的良好輔助用藥[5]。本研究證實(shí)消巖湯可防止腫瘤惡液質(zhì)機(jī)體消瘦，并能有效縮小瘤體，增加抑瘤率，具有扶正抑瘤作用；其對肺癌耐藥細(xì)胞的殺傷作用較敏感，不但能殺傷肺癌耐藥細(xì)胞，還能增強(qiáng)化療藥物對耐藥細(xì)胞的殺傷作用，具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用，從而為中醫(yī)藥治療肺癌的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Parkin D M,Bray F B,Pisani P.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.

[2] 徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005∶1757-1766.

[3] 劉文哲，李金瀚，胡義德，等.順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞系多重抗藥性的形成[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，1999，6(1)：13-16.

[4] 詹茂程，劉敘儀，蔡 鵬.耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP耐藥機(jī)理進(jìn)一步探討[J].中國腫瘤臨床，1998，25(10)∶726-728.

[5] 賈英杰，張 瑩，孫一予，等.消巖湯不同時(shí)段參與化療治療非小細(xì)胞肺癌臨床療效觀察[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（3）：164-165.