李 楊，柳紀省,2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種感染偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，該病一旦爆發(fā)，將造成巨大的經(jīng)濟損失，是OIE規(guī)定的一類傳染病。FMDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約8.5 kb，由5′端非編碼區(qū)、一個開放閱讀框和3′端非編碼區(qū)和Poly（A）組成[2]。P1編碼區(qū)決定著病毒的抗原性和血清型[3]，其結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1位于全基因組的2 977～3 615核苷酸位點，編碼213個氨基酸，為主要抗原位點，可產(chǎn)生中和抗體，誘導免疫反應，是重點研究對象[4]。編碼FMDV的3種主要蛋白水解酶分別為L、2A和3C基因。其中，3C是一種極為重要的功能蛋白，其在多聚蛋白的裂解及病毒衣殼的組裝過程中裂解病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1，最終得到成熟的病毒抗原[5]，還可使帽結(jié)構(gòu)宿主細胞蛋白的合成關(guān)閉，為病毒蛋白的合成創(chuàng)造條件[6]。鑒于在蛋白酶3C的作用下前體結(jié)構(gòu)蛋白P1最終裂解為 VP1、VP2、VP3、VP4[7]，組裝成為完整的病毒粒子誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應答[8]。筆者選用O型口蹄疫病毒的P1-2A和3C基因，以期獲得能夠高效表達具有免疫原性的FMDV抗原的重組腺病毒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OMⅢ型口蹄疫病毒、腺病毒表達系統(tǒng)（穿梭載體pAdTrack-CMV、骨架載體pAdeasy-1）；大腸桿菌BJ5183（中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供）；HEK293細胞（由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗）；克隆載體pMD18-T、JM109、DNA Marker、Pyrobest DNA polymeras、T4DNA連接酶、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械龋ù筮B寶生物工程有限公司）；限制性內(nèi)切酶 PacⅠ、PmeⅠ、salⅠ、BglⅡ、xbaⅠ（Biolabs公司）；RNA提取試劑盒（Qiagen公司）；脂質(zhì)體lipofectAMINE2000（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.2 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank參考序列合成2對引物：P1-2A上 游 引 物 5′-ATAAGATCTACCATGGGAGCC-3′（引入 BglⅡ酶切位點）；P1-2A下游引物 5′-CGCGTCGACTGACATGTCCTC-3′(引入 salⅠ酶切位點)。PCR 擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃30 s，72℃ 3 min，共 30 個循環(huán)；72℃延伸 10 min。3C上游引物 5′-GCGGTCGACAAGAAACCTGTC-3′（引入salⅠ酶切位點）；3C下游引物5′-ATATCTAGACTACTCGTGGTG-3′（引入 xbaⅠ酶切位點）。PCR 擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。以上引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

按Qiagen公司的RNA提取試劑盒說明提取RNA，將總RNA用Oligo（dT）18引物在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42℃反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用2對特異性引物進行PCR擴增P12A和3C，將目的片段按常規(guī)方法連接到pMD18-T載體上。用相應的核酸內(nèi)切酶進行酶切鑒定，凝膠電泳鑒定后送大連寶生物工程有限公司測序鑒定。將連接產(chǎn)物分別用BglⅡ/salⅠ和salⅠ/xbaⅠ酶切，分別與經(jīng)同樣兩次酶切的腺病毒穿梭載體pAdTrack進行連接，使其處于強啟動子CMV控制下。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，抗性篩選陽性克隆后，提取質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定，命名為pAdTrack-P12A3C。

1.4 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

pAdTrack-P12A3C經(jīng)PmeⅠ線性化后與腺病毒骨架載體pAdeasy-1共同電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌BJ5183，進行PacⅠ酶切鑒定和PCR鑒定，該重組腺病毒質(zhì)粒命名為pAd-P12A3C。

1.5 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞及遺傳穩(wěn)定性檢測

用PacⅠ將pAd-P12A3C質(zhì)粒線性化后，在Lipofectamine 2000的介導下轉(zhuǎn)染HEK293細胞，轉(zhuǎn)染后4～5 d細胞可觀察到綠色熒光，傳代后出現(xiàn)典型的細胞病變。反復凍融后離心，取上清液接種于單層HEK293細胞，并依次傳至第10代。提取每代腺病毒基因組DNA，以此為模板擴增FMDV的P1-2A、3C基因，檢測重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因P1-2A、3C的擴增及重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

以篩選出的陽性質(zhì)粒為模板分別擴增目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測分別可見大小約2.3 kb和640 bp的片段條帶，與目的基因大小相符。將穿梭載體pAdTrack和T-P12A同時經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ和salⅠ酶切后進行粘末端連接，鑒定連接成功后獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-P1-2A，再用限制性核酸內(nèi)切酶salⅠ和XbaⅠ同時酶切pAdTrack-P12A和T-3C進行粘末端連接，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約2.9 kp的條帶，證明P12A和3C基因已成功克隆到了pAdTrack中（見圖1、圖 2、圖 3）。

圖1 O型FMDV 3C基因的擴增

圖2 O型FMDV P1-2A基因的擴增

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-P12A3C的鑒定

pAd-P12A3C質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ消化后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見大小約為4.5 kb的條帶，和預期結(jié)果相符。序列測定及分析也證實了目的基因已正確重組到腺病毒骨架載體內(nèi)（圖4）。

2.3 重組病毒遺傳穩(wěn)定性和表達的檢測

分別提取1～10代細胞總DNA為模板進行外源基因的PCR擴增，每代均擴增出目的基因，說明重組病毒能穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)染的單層HEK293細胞48 h后采用間接免疫熒光試驗，在熒光顯微鏡下可見特異的綠色熒光，而轉(zhuǎn)染腺病毒骨架載體的HEK293細胞經(jīng)同樣處理后無熒光，證明目的基因在腺病毒載體中成功表達，HEK293細胞中含有FMDV 蛋白（圖 5、圖 6、圖 7）。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定

圖4 重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定

3 討論與結(jié)論

圖5 對照組正常HEK293細胞

圖6 接毒試驗組

圖7 重組腺病毒感染HEK293細胞后的綠色熒光表達

目前，世界多數(shù)國家都采用疫苗免疫的方法來控制FMD疫情，F(xiàn)MD基因工程疫苗的研究已經(jīng)歷20 a，由于免疫效果不及傳統(tǒng)的滅活苗，迄今僅有個別的產(chǎn)品上市，且市場占有率非常有限。究其原因，影響FMD基因工程疫苗免疫效力的因素較多，但其中最重要的原因之一是，不論原核表達還是真核表達，也不論是基因重組表達的亞單位疫苗還是用重組DNA進行免疫的核酸疫苗，多數(shù)研究工作都是圍繞FMDV單個基因VP1在進行不同途徑的探討，而一些能增強免疫作用的基因卻未被發(fā)現(xiàn)和利用[8]。2001年美國的Mary通過對FMDV全結(jié)構(gòu)蛋白基因及非結(jié)構(gòu)蛋白基因功能的研究，根據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白（3C蛋白酶）可將全部結(jié)構(gòu)蛋白基因P1的產(chǎn)物加工成結(jié)構(gòu)完整的VP1、VP2、VP3和VP4多肽，從而形成完整的病毒衣殼。因而，就能最大限度地保留病毒顆粒上的多個抗原表位的情況，研究了FMDVP1+3C活載體疫苗。用該疫苗免疫的豬在同居感染試驗中，獲得了5/6的保護。這一試驗結(jié)果表明，從全基因組水平篩選出的組合基因表達的融合蛋白的免疫效力已超過常規(guī)疫苗[9]。在口蹄疫活病毒載體疫苗研究中，目前FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因已在大腸埃希氏菌、畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因植物和桿狀病毒等表達系統(tǒng)中得到表達[10]，腺病毒載體是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應用開發(fā)較早的一種病毒載體。其具有宿主范圍廣、對人致病性低、在增殖和非增殖細胞中感染、表達基因能同時表達多個基因、能在懸浮培養(yǎng)液中擴增等獨特的優(yōu)點[11]。基于以上優(yōu)點，腺病毒被極其廣泛地應用于體外基因轉(zhuǎn)導、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個領域[12]。

實驗從FMDV全基因組水平篩選具有保護性免疫反應的免疫組合基因（免疫基因的主序列）作為目的基因，將目的基因插入腺病毒表達載體，通過脂質(zhì)體、電穿孔法轉(zhuǎn)化293細胞成功實現(xiàn)目的基因的表達。通過不同的分子檢測方法檢測，篩選出高效表達毒株。該試驗為最終研制出安全、高效、實用的能表達FMD抗原的復制缺陷型腺病毒活載體疫苗提供了一些數(shù)據(jù)。

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