韓彥江 程登峰 張 嵐 鄭明強(qiáng) 周 偉尹端沚 武明星 馬玉飛 汪勇先

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所放藥中心 上海 201800）

2（中國(guó)科學(xué)院研究生院 北京 100049）

癌癥的發(fā)病率一直呈高增長(zhǎng)勢(shì)頭，其近端和遠(yuǎn)端發(fā)生轉(zhuǎn)移是癌癥分期的重要標(biāo)志，也代表著治療后痊愈、恢復(fù)及生存機(jī)會(huì)的高低。研究表明，趨化因子(Chemokines)及其受體(Chemokine Receptors)與癌癥的發(fā)病及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。趨化因子是不同類(lèi)型細(xì)胞分泌的低分子量(8–10 kd)的細(xì)胞因子，它們對(duì)各種白細(xì)胞亞類(lèi)，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化和預(yù)激活作用[1]。趨化因子受體是一類(lèi)表達(dá)于不同類(lèi)型細(xì)胞上的含有7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體。趨化因子通過(guò)作用于趨化因子受體參與多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等，通過(guò)趨化吸引白細(xì)胞、調(diào)節(jié)其效應(yīng)功能等參與免疫應(yīng)答過(guò)程[2]。

基質(zhì)衍生因子(SDF-1，又名CXCL12)是主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成釋放的趨化因子，屬CXC亞族，其受體為CXCR4。SDF-1在人的T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞中有表達(dá)，在人的胰臟、小腸、卵巢、脾臟等器官更有高度表達(dá)。CXCR4受體分布在B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成熟巨核細(xì)胞上。SDF-1與CXCR4相互結(jié)合發(fā)揮作用，是SDF-1發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。SDF-1與 CXCR4對(duì)生物學(xué)軸不僅參與胚胎、血管、神經(jīng)、心臟形成，還參與T、B等免疫細(xì)胞和造血干細(xì)胞發(fā)生及遷移等正常生理活動(dòng)[3–7]。近年研究表明，SDF-1和CXCR4與慢性炎癥、HIV-1的病毒轉(zhuǎn)錄、多種腫瘤的特異性轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[8–14]。目前，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等眾多腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有CXCR4的高表達(dá)，并且CXCR4已成為腫瘤診斷與治療的新靶點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視。

CXCR4受體的抑制劑包括小分子、多肽類(lèi)抑制劑，具有治療艾滋病和其他相關(guān)疾病的潛力?；瘜W(xué)小分子AMD3100已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為動(dòng)員干細(xì)胞遷移的臨床藥物[15]。多肽類(lèi)抑制劑包括ALX-40-4C[16]、 CTCE-9908[17]、FC131[18]、POL3026[19]和 T140[20]。T140是一類(lèi)對(duì) CXCR4受體與其單抗的結(jié)合具有很強(qiáng)抑制作用的十四肽，其第二位的精氨酸(Arg2)、第3位的L-3(2-萘基)丙氨酸(NaI3)、第五位的酪氨酸(Tyr5)和第十四位的精氨酸(Arg14)組成了其藥效活性區(qū)域[21]。本研究的目的是發(fā)展一種CXCR4的受體顯像劑。為提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，將多肽的C端氨基化，N端乙?；?，因標(biāo)記需要，保留了第八位的賴氨酸，將第七位的賴氨酸換成了精氨酸，這樣形成了多肽 T140的類(lèi)似物AcTZ14011，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

已報(bào)道的CXCR4受體的顯像劑有99mTc標(biāo)記的SDF-1[22]、Cu64標(biāo)記的小分子amd3100[23]和111In 標(biāo)記的多肽AcTZ14011[24]。目前，我國(guó)提供臨床使用的正電子核素是11C和18F，其中18F核素性質(zhì)優(yōu)良：半衰期較長(zhǎng)(T1/2=109.8 min)，正電子能量較低(0.64 MeV)而對(duì)正常組織的輻射損傷較小，氟的范德華半徑(0.135 nm)與氫(0.12 nm)相似而不影響標(biāo)記化合物的生物活性。我國(guó)的新建醫(yī)用回旋加速器增多、18F的來(lái)源范圍更為廣泛，為18F標(biāo)記化合物的研發(fā)提供了便利。N-琥珀酰亞胺-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)是18F標(biāo)記多肽和蛋白質(zhì)中最常用的中間體，只要目標(biāo)分子中有賴氨酸的ε氨基，就可進(jìn)行標(biāo)記，其合成方法簡(jiǎn)便，放化產(chǎn)率高。本研究旨在探討18F通過(guò)[18F]SFB標(biāo)記多肽AcTZ14011及其條件的優(yōu)化。

圖1 多肽AcTZ14011的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖Fig.1 Structure of peptide AcTZ14011 Nal: l-3-(2-naphthyl)alanine, Cit: l-citrulline.

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 試劑與材料

前體乙基-4-三甲胺苯甲酸酯-三氟磺酸鹽和對(duì)照品 N-琥珀酰亞胺-4-氟苯甲酸酯(SFB)按照文獻(xiàn)[25]直接合成。多肽AcTZ14011購(gòu)自蘇州中科天馬肽工程中心有限公司，純度大于 90%。K222(Kryptofix 222)、無(wú)水乙腈和無(wú)水碳酸鉀，美國(guó)Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；乙腈，HPLC級(jí)光譜純，美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；4-氟苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N’-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)、乙基一二甲胺苯甲酸醋、CH3SO3CF3、O-(N-琥珀酰亞胺)N,N,N’,N’一四甲基脲四氟硼酸鹽(TSTU)，購(gòu)自瑞士 Fluka公司；四氫呋喃、氫氧化四丙基胺 (1 mol/L的水溶液)購(gòu)自德國(guó) Aldrich公司；富[18O]氧水，以色列Rotem公司產(chǎn)品。氫氧化鈉、濃鹽酸、碳酸氫鈉、乙醇、無(wú)水乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純或光譜純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。除注明外，化學(xué)藥品均未經(jīng)進(jìn)一步純化，直接使用。

Sep-Pak QMA柱、C18柱，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；GF254薄層層析硅膠板(2.5 cm×10.0 cm，玻璃基片)，煙臺(tái)匯友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；Millex?GS 0.22 μm微孔過(guò)濾器，美國(guó)Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

醫(yī)用回旋加速器(Eclipse ST，40 μA，11 MeV)；Brucker AM-300(300M)核磁共振儀；FJ-391A2型微機(jī)放射性活度計(jì)(北京核儀器廠)；高效液相系美國(guó)Dionex公司，配有P680泵、PDA-100 光電二極管陣列探測(cè)器以及 Bioscan Flow-Count 探測(cè)器(美國(guó)Bioscan公司)；Radio-TLC薄層掃描儀(Bioscan AR-2000，美國(guó)Bioscan公司)；WRS-1A數(shù)字熔點(diǎn)儀；RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海滬西分析儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 [18F]離子的產(chǎn)生

無(wú)載體的18F離子由18O(p,n)18F反應(yīng)產(chǎn)生。加速器轟擊后，在N2壓力下，含18F離子的富氧水通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的QMA柱，18F離子吸附于柱上，富氧水則收集于回收瓶中。

2.2 [18F]SFB的放化合成

用 1.5 mL K2CO3溶液(0.02 mmol/L，含 K22217.72 mg)將18F洗脫進(jìn)一個(gè)5 mL的Mini- vial(美國(guó)Alltech公司)中，與0.4 mL乙腈在100℃共沸蒸干兩次。向盛有干18F的反應(yīng)瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸鹽(5 mg，16 μmol，溶于0.3 mL無(wú)水乙腈)，100℃加熱10 min。反應(yīng)液冷卻后，加入1 mol/L的NaOH 0.7 mL，110℃反應(yīng)5 min，冷卻后加入1 mol/L的HC1 0.9 mL，反應(yīng)液通過(guò)一活化的Sep-Pak C18柱，先用2 mL的0.01 mol/L鹽酸淋洗，用N2吹干Sep-Pak C18柱，再用3 mL乙睛洗脫得到4-[18F]氟苯甲酸。將20 μL氫氧化四丙基胺的水溶液加入其中，100℃共沸干燥，加入 12 mg TSTU(溶于0.25 mL乙腈中)，90℃反應(yīng)5 min。然后用3 mL的5%醋酸酸化，再用6 mL水稀釋。將上述溶液通過(guò)一活化的Sep-Pak C18柱，依次用10 mL乙睛/水(V:V=1/3)淋洗，用N2吹干Sep-Pak C18柱，用2 mL二氯甲烷洗脫。TLC、HPLC測(cè)放射化學(xué)純度和測(cè)活度，計(jì)算放化產(chǎn)率。

2.3 [18F]SFB與多肽的偶聯(lián)

將用來(lái)溶解[18F]SFB的二氯甲烷吹干，加入50μL乙腈溶解，加入100 μg多肽AcTZ14011 (溶于150 μL pH 8.5的0.1 mmol/L硼砂－硼酸緩沖液)，42℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)液通過(guò)HPLC分離。HPLC系統(tǒng)采用如下梯度制備法(其中A為含0.1%三氟乙酸的水溶液，B為含 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液)：0–25 min內(nèi)95%–10%溶劑A，25–30 min內(nèi)10%A，30–35 min內(nèi) 10%–95%A，流速 2.5 mL/min。

2.4 標(biāo)記多肽的質(zhì)量控制

將HPLC流出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用醫(yī)用0.9% NaCl注射液溶液，NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0左右，過(guò)0.22 μm濾膜，所得液體重新進(jìn)HPLC測(cè)放射化學(xué)純度，測(cè)活度，計(jì)算放化產(chǎn)率。

3 結(jié)果與討論

3.1 [18F]SFB的放化合成

三步法合成[18F]SFB(圖2)介紹如下：

第一步是氟的親核取代反應(yīng)，在保證嚴(yán)格無(wú)水的條件下，產(chǎn)率一般較高。其中溫度是很重要的影響因素，溫度越高，氟化時(shí)間越短，但副反應(yīng)發(fā)生的幾率也越高，因此一般反應(yīng)溫度為90–100℃，另外前體的量的多少直接決定了第二步需要的堿和酸的多少。我們采用無(wú)水乙腈作為溶劑，前體投量5–8 mg，此時(shí)標(biāo)記率為95% (n≥5)。

圖2 [18F]SFB的三步法合成步驟Fig.2 Three-step radiosyntheses of [18F]SFB.

第二步，唐剛?cè)A等[29]用氫氧化四丙基胺來(lái)水解，生成四丙基銨鹽，實(shí)現(xiàn)一鍋法合成[18F]SFB，可采用模塊實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成。而Wüst和Azarian等[30,31]對(duì)不同前體用三氟乙酸作為水解試劑。我們采用氫氧化鈉使之完全水解，生成[18F]對(duì)氟苯甲酸鈉，加入過(guò)量鹽酸中和，生成[18F]對(duì)氟苯甲酸([18F]FA)，再用C18柱除去未反應(yīng)前體和18F離子。

第三步，Vaidyanathan等[26,27]用DCC作為活化劑，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min；后采用DSC，縮短了反應(yīng)時(shí)間，但活化溫度高達(dá) 150℃，且所得產(chǎn)物混有中間體碳酸鹽，須進(jìn)行正相HPLC分離。我們采用離子化試劑TSTU，反應(yīng)溫度為90–95℃，時(shí)間僅需5 min，還可用SPE柱代替HPLC實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品分離。

三步反應(yīng)的總放化產(chǎn)率 25%(未經(jīng)衰變校正)，合成時(shí)間70 min，放射化學(xué)純度>98%(圖3)。

Matthias Glaser等[32]2009年發(fā)明的二步法合成[18F]SFB(圖 4a)，用催化劑(diacetoxyiodo) benzene實(shí)現(xiàn)了從[18F]FBA到[18F]SFB的一步直接合成，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間；而Ran Yan等[33]用一步法合成了[18F]SFB(圖4b)，產(chǎn)率13%–23%。這兩種方法均在實(shí)驗(yàn)室摸索階段，未放大生產(chǎn)，但他們代表了合成[18F]SFB的新方向。

圖3 經(jīng)過(guò)sep-pak分離后的[18F]SFB放射性HPLC圖譜(采用分離多肽程序)Fig.3 HPLC radio chromatogram of [18F]SFB using gradient of peptide preparation after sep-pak separation.

圖4 二步法(a)和一步法(b)合成[18F]SFBFig.4 Two-step (a) and one-step (b) radiosyntheses of [18F]SFB[32,33].

3.2 與多肽的偶聯(lián)(圖5)

SFB標(biāo)記多肽的穩(wěn)定性好，不易脫氟，放化產(chǎn)率高，通過(guò)[18F]SFB標(biāo)記了不少多肽，諸如人C肽(Human C-peptide)[34]，神經(jīng)緊張素肽(Neurotensin)[35]，鈣磷脂結(jié)合多肽-V(Annexin-V)[36]，胰島素(Insulin)[37]，蛙皮素(Bombesin)[38]，血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide)[39]，RGD多肽(RGD peptides)[40,41]以及奧曲肽(Oligonucleotides)[42]。影響[18F]SFB標(biāo)記多肽的因素主要有反應(yīng)體系、多肽濃度、pH值、溫度等。反應(yīng)體系一般有兩種：二甲基亞砜/N,N-二甲基甲酰胺/N,N-二異丙基乙胺(DMSO/DMF/DIPEA)，以及硼酸緩沖液/乙腈。多肽AcTZ14011在硼酸緩沖液中溶解性很好，我們選用后者作為反應(yīng)溶劑。在理論上，多肽濃度越高，標(biāo)記率也高，但考慮成本因素，本文實(shí)驗(yàn)用100 μg溶于150 μL緩沖液，[18F]SFB溶解于50 μL乙腈，考察pH值、溫度對(duì)標(biāo)記率的影響。

圖6是反應(yīng)條件對(duì)[18F]SFB標(biāo)記多肽的影響。由圖6a，該標(biāo)記反應(yīng)對(duì)pH依賴很?chē)?yán)重，pH靠近中性，幾乎不反應(yīng)；pH=9.2時(shí)，大部分SFB都發(fā)生水解形成了[18F]FA，pH=8.5的產(chǎn)率最高，為37.6±2.1%(n=3)。由圖 6b，溫度越高，標(biāo)記率也越高，但是溫度太高容易造成多肽的分解。我們的反應(yīng)溫度定為42℃。由此，反應(yīng)的最佳參數(shù)為：溫度42℃，[18F]SFB溶于50 μL乙腈，100 μg多肽溶于150 μL pH 8.5 的緩沖液。

圖5 [18F]SFB偶聯(lián)多肽示意圖Fig.5 Scheme of [18F]SFB conjugated with peptide AcTZ14011.

圖6 pH(a)和溫度(b)對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.6 pH dependence of the RCY of labeling with [18F]SFB (a) and influence of the reaction temperature (b).

圖7 經(jīng)制備后的標(biāo)記多肽[18F]FB-AcTZ14011 (a)和未標(biāo)記多肽(b)的HPLC圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of the puri fi ed [18F]FB-AcTZ14011. (a) and HPLC profiles of AcTZ14011 (b),using the gradient of peptide preparation.

3.3 質(zhì)量控制

HPLC純化后的標(biāo)記多肽[18F]FB-AcTZ14011溶液經(jīng)過(guò)旋干，加入生理鹽水注射液后再調(diào)節(jié)pH值，經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后所得溶液澄清透明。取溶液進(jìn)放射性HPLC測(cè)其放射化學(xué)純度>96%，并且標(biāo)記多肽的放射性峰與未標(biāo)記多肽的UV峰完全分開(kāi)(圖7)。經(jīng)過(guò)6 h標(biāo)記多肽在PBS中的穩(wěn)定性仍>90%。

4 結(jié)論

本研究以[18F]SFB 為中間體，對(duì)多肽AcTZ14011進(jìn)行了18F標(biāo)記，整個(gè)合成時(shí)間為180 min (包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，HPLC分離等各項(xiàng)操作)，產(chǎn)率為3%(未經(jīng)衰變校正)，標(biāo)記的多肽溶液澄清透明，放化純度>96%，為隨后進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)打下了基礎(chǔ)。

致謝本研究所用18F由上海復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院PET中心提供，對(duì)張勇平工程師和王明偉博士的熱心幫忙表示感謝！

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