陳海龍,賈愛萍

(山西省林木良種培育中心,山西 襄汾 041500)

油松天然群體種子、球果形態(tài)及同功酶遺傳變異研究

陳海龍,賈愛萍

(山西省林木良種培育中心,山西 襄汾 041500)

對5種油松天然群體同功酶的研究表明:1)5種群體在GO T,ADH,SDH,M DH的分析中均有不同的譜帶表現(xiàn);在M E分析中所有的單株中均有 1條清晰的譜帶,屬于 1個染色區(qū),受 1個位點控制,該位點只有 1個等位基因,屬單態(tài)位點。2)5種群體在7個位點的等位基因頻率和平均期望雜合度在不同酶位點間存在著較大的異質(zhì)性。3)群體間的遺傳分化主要來自群體內(nèi)個體間,平均占總?cè)后w的95.02%。

油松;天然群體;同功酶

油松是我國主要的鄉(xiāng)土樹種,分布范圍廣,遺傳變異大,具有很大的遺傳改良潛力,開展油松遺傳變異研究具有十分重要的意義。本項研究對山西省文水縣三道川林場的 5種油松天然群體在形態(tài)和分子水平上的變異和分化進行分析,研究和評價遺傳多樣性狀況,為當?shù)赜退傻倪z傳改良提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

試驗所用材料采自山西省文水縣三道川林場。選取生長良好,林相整齊,無病蟲害的 5種油松天然林分(見表1),每種林分選出 10棵單株作為樣木,樣木間距25 m以上。

表1 不同林分地理位置

1.2 研究方法

1.2.1 形態(tài)特征的測量

1)油松針葉長的測量:針葉采自樹冠上部 1/3處,分單株帶回。取每株樣木的針葉33束,分別測量其長度,每10個測量值作平均進行統(tǒng)計分析。

2)油松球果大小的測量:球果采自樹冠中上部東、南、西、北 4個方位,每個方位采 5個,每株共采20個,測量其長、寬,每株樣木重復 8次。

3)油松種子百粒重的測量:將測量后的油松球果放于太陽下暴曬,得到單株種子。隨機抽取100粒種子稱重,重復 3次,取平均值,得到各單株的種子百粒重。

1.2.2 同功酶試驗

1)酶液的制備。在各群體的每個單株上取自由授粉種子 30粒,用水沖洗干凈后,置于 25°C溫水中浸泡 2 d,然后在濕潤濾紙上繼續(xù)培養(yǎng) 3 d～ 5 d,至種子露白時,剝?nèi)∶苛７N子的單倍體胚乳,放入指形管中,加入1 mL樣品提取液 (pH值7.6,0.2 mol/L的磷酸緩沖液),在冰浴中研磨成勻漿,倒入離心管,再將 1 mL 40%的蔗糖溶液沖入離心管,冷凍離心(0°C,10 000 r/min)10 min,然后取上清液,將其置于 (0°C～ 4°C)冰箱內(nèi) ,貯存?zhèn)溆谩?/p>

2)凝膠的制備。按表2的比例制備分離膠和濃縮膠。分離膠的濃度是 10%,制備20 mL;濃縮膠的濃度是 4%,制備 5 m L。

表2 凝膠的制備

3)電泳。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法。4種酶的緩沖系統(tǒng)見表3。用100 V電壓預(yù)電泳 1 h,再用250 V電壓繼續(xù)電泳 3.0 h～3.5 h。待溴酚蘭指示劑移至液面 1 cm時,停止電泳,準備剝膠染色。

4)染色。谷草轉(zhuǎn)氨酶:稱取 0.073g α-酮戊二酸,0.267 5 g天冬酸,1.0 g PVP,0.1 g EDTA和2.84 g Na2HPO4溶于少量蒸餾水中,定容至200 mL,配制成 GOT底物溶液。稱取 0.05 g固藍 BB溶于50 m L GOT底物溶液,即為染色液。將凝膠取出放入染色缸,倒入染色液,黑暗中37°C溫育膠,直到呈現(xiàn)棕色的酶活性區(qū)帶。

表 3 4種酶緩沖系統(tǒng)

乙醇脫氫酶:稱取 NAD 15 mg,NBT 15 mg,PMS(吩嗪二甲酯硫酸鹽)2.5 mg,量取 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液50 mL,混勻作為染色液。染色前,加 5 mL 95%乙醇作底物。電泳后剝下的凝膠板放在染色液中,37°C溫至顯現(xiàn)深藍色的條帶時,停止染色,倒掉染色液,用蒸餾水沖洗,拍照記錄。

山梨醇脫氫酶:稱取150 mg山梨醇,溶于 30 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中,10 mg NAD,10 mg M TT和 5 mg PMS溶于 20 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 1.0 mL 1% MgCl2,將3種溶液混勻后即為染色液。取出凝膠放入染色缸,倒入染色液,黑暗中溫育膠 30 min～ 60 min,直到藍帶顯示。

蘋果酸酶:稱取 10 mg NADP,10 mg M T T和5 mg PMS溶解于 10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 5 mL 1% MgCl2和 25 mL 0.5 mol/L蘋果酸(pH 7.0),混入上述溶液,即為染色液。取出凝膠放入染色缸,倒入染色液,黑暗中溫育膠,直到譜帶顯示。

蘋果酸脫氫酶:稱取 10 mg NAD,10 mg NBT,5 mg PMS溶解于 25 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 25 mL 0.5 mol/L蘋果酸 (pH 7.0),混入上述溶液,即為染色液。取出凝膠放入染色缸,倒入染色液,溫育膠,直到譜帶顯示。凝膠在黑暗中37°C保溫 2 h以上,酶帶活性區(qū)帶呈現(xiàn)深藍色。

5)同功酶位點的確定和等位基因的命名。在表示同功酶位點和等位基因時,由酶的縮寫字母代表酶系統(tǒng),連字符后的數(shù)字代表不同的位點,距正極最近的位點為1,其他各位點依次用2,3,4,…表示。對同一位點,等位基因的確定根據(jù)譜帶的遷移率,依次用 A,B,C,…表示。無活性或活性極弱的譜帶用SA表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 油松群體間形態(tài)特征值變異分析

所測定的 5種油松林分針葉、球果、種子性狀特征值見表 4。

表 4 5種油松林分針葉、球果、種子性狀特征值

從表 4可以看出,油松不同群體間針葉長變幅為 7.3 cm～ 12.9 cm;球果長變幅 4.2 cm～6.6 cm,球果寬變幅 2.9 cm～ 4.4 cm;百粒重變幅 3.3 g～6.4 g。針葉和球果的變異系數(shù)明顯小于百粒重的變異系數(shù),說明百粒重受環(huán)境影響較大。

進一步對油松不同群體間針葉、球果、種子性狀特征值進行方差分析,見表 5。

表 5 針葉、球果、種子性狀方差分析

由表 5看出,各性狀方差分析結(jié)果表明,在α=0.05水平上,各形態(tài)特征在群體間和群體內(nèi)均無顯著差異。

2.2 同功酶分析

2.2.1 酶譜分析

1)GOT:在所有分析的單株中均有 2個染色區(qū),分別定名為 GOT-1和 GOT-2。 GOT-1有2種譜帶表現(xiàn)形式,1種是最常見的慢帶(等位基因 A),1種是快帶(等位基因 B)。 GOT-2有 3種酶譜表現(xiàn)形式。GOT重復性好,在林木研究中已有很多報道,不同樹種在 GOT的位點上存在差異。

2)ADH:在分析的單株中有 1個染色區(qū),受1個位點控制,有3種譜帶表現(xiàn)形式。

3)SDH:在分析的單株中有 1個染色區(qū),受1個位點控制,有3種譜帶表現(xiàn)形式。

4)MDH:在分析的單株中有 2個染色區(qū),受2個位點 (MDH-1,MDH-2)控制 ,其中 MDH-1有3種譜帶表現(xiàn)形式,MDH-2有 4種譜帶表現(xiàn)形式。目前,大部分研究中報道,MDH受 4個位點控制,但也有一部分報道受 3個或 2個位點控制。

5)M E:在所有的單株中均有 1條清晰的譜帶,屬于 1個染色區(qū),受1個位點控制。該位點只有1個等位基因,屬單態(tài)位點。

2.2.2 群體基因變異水平

5種群體在 7個位點上的等位基因頻率(fij)和平均期望雜合度 (He),見表 6。

表 6 5種群體的等位基因頻率及期望雜合度

從表 6知,有 6個位點(GOT-1,GOT-2,ADH-1,SDH-1,MDH-1,MDH-2)是多態(tài)的,1個位點是單態(tài)的(ME-1)。各個位點在 5種群體中的He平均值,按大小次序為 SDH-1(0.398),ADH-1(0.251),MDH-1(0.238),MDH-2(0.223),GOT-1(0.197),GOT-2(0.126)和M E-1單態(tài)位點。群體平均期望雜合度的平均值在位點間變化范圍較大,說明不同位點間存在著較大的異質(zhì)性。

進一步對 5種群體的遺傳參數(shù)進行分析,見表7。

表7 5種群體的遺傳參數(shù)

由表 7可見,多態(tài)位點百分率在 5種群體間相同。群體平均期望雜合度(He)代表了群體內(nèi)雜合體的比例,在 5種群體中,變化范圍為 0.153～ 0.251,平均為 0.208。等位基因平均數(shù)直觀地反映了群體內(nèi)等位基因的豐富度,其變化范圍為 2.00～ 2.43,群體間變異很小。可見,5種群體的 3個遺傳多態(tài)參數(shù)的均值較小,說明這 5種群體在研究的酶位點上變異水平較低。

2.2.3 群體間的遺傳分化

為確定所研究的5種油松天然群體同功酶位點上的變異總量在群體間和群體內(nèi)的分布情況,對群體變異量(Hs)、總變異量(Ht)做基因多樣度分析并計算群體分化值(Gst),結(jié)果見表8。

表 8 遺傳分化參數(shù)

從表 8中看出,Gst值在位點間變動幅度較大,變化范圍從 0.006 0～0.070 9。 7個位點上的Gst平均值為 0.049 8,即群體間的變異量平均占總?cè)后w的4.98%,而大多數(shù)的變異(95.02%)存在于群體內(nèi)。

2.2.4 群體遺傳距離

為了進一步分析 5種油松群體間的相似程度,依據(jù)表6中的等位基因頻率計算出各群體間的遺傳距離 (Nei's方法),結(jié)果見表 9。

表 9 各群體間的遺傳距離

從表 9知,群體 4與群體 5遺傳距離為 0.991 3,群體 1與群體 4,群體 5的遺傳距離分別為 0.986 4和0.990 5。5種群體的遺傳距離變動范圍較小,非常接近,說明群體間的分化程度不高。

3 結(jié)論與討論

1)5種油松群體間針葉、球果、種子的形態(tài)特征值之間差異不顯著。

2)酶譜分析表明,GOT在所有分析的單株中均有 2個染色區(qū),分別定名為 GOT-1和 GOT-2。ADH在分析的單株中有 1個染色區(qū),受 1個位點控制,有 3種譜帶表現(xiàn)。 SDH在分析的單株中有 1個染色區(qū),受 1個位點控制,有 3種譜帶表現(xiàn)。MDH在分析的單株中有 2個染色區(qū),受 2個位點(MDH-1,MDH-2)控制,其中 MDH-1有 3種譜帶表現(xiàn)形式,MDH-2有4種譜帶表現(xiàn)形式。ME在所有的單株中均有 1條清晰的譜帶,屬于 1個染色區(qū),受 1個位點控制,該位點只有 1個等位基因,屬單態(tài)位點。

3)群體基因變異水平表明,5種群體在 7個位點的等位基因頻率(fij)和平均期望雜合度(He)在不同酶位點間存在著較大的異質(zhì)性。 5種群體的遺傳參數(shù)結(jié)果表明,多態(tài)位點百分率、群體平均期望雜合度、等位基因的遺傳差異都很小。

4)群體間的遺傳分化主要來自于群體內(nèi)個體間(95.02%)。群體間的變異量很小,平均占總?cè)后w的4.98%。

[1]葛 頌,黃敏仁.馬尾松 GO T.LDH-UM DH同功酶的遺傳卞式和連鎖關(guān)系[J].遺傳學報,1987,14(2):428-435.

[2]楊一平.長白山紅松林同功酶遺傳變異的研究 [J].東北林業(yè)大學學報,1986,14(2):34-41.

[3]胡能書 .同功酶技術(shù)及其應(yīng)用[M].長沙:湖南科學技術(shù)出版社,1985.

Study on Seed of Natural Population,Cone Morphology and Genetic Variation of Chinese Pine

Chen Hailong,Jia Aiping
(Fine Cultivar Breeding Center of Shanx i,041500Xiangfen,China)

The study on isoenzyme of5natural population of Chinese pine was carried out.The results showed that:1)Five populations all showed different band type in the analysis of GOT,ADH,SDH and MDH.Also,each plant has a clear band for M E analysis,which belongs to the same staining region controlled by one gene locus site where there is only one allele of singlet site.2)There exist differences on allele frequency of 7 sites and expected heterozygosity in 5populations among different enzyme sites. 3)Genetic differentiation among populations is mainly from individuals in the intrapopulations,accounting for 95.02% of the whole population.

Chinese pine;naural population;isoenzyme

S791.254

A

1007-726X(2010)01-0004-04

國家林業(yè)局“六大”重點林業(yè)工程科技專項(2003-007-L07)

2009-12-25

陳海龍(1965- ),男,山西襄汾人,1991年畢業(yè)于北京林業(yè)大學,工程師。