馬曉君, 姜兆林, 李 婧, 徐仿敏, 戚文杰, 李 強, 項 陽

(1.唐山市公安局刑警支隊,河北唐山 063000;2.中國刑事警察學院,遼寧沈陽 110035)

0 引言

分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)是最近發(fā)展起來的對目標分子有特異選擇性的吸附劑。由于這種印跡聚合物對印跡分子具有生物實體的專一識別性,而且與生物實體相比具有穩(wěn)定性好、抗惡劣環(huán)境能力強、使用壽命長等優(yōu)點,因而受到廣泛的重視和關(guān)注[1-2]。

嗎啡是當前的主要毒品之一,血中嗎啡的測定結(jié)果是確定吸食毒品者是否吸食鴉片類毒品的重要證據(jù)。在實際工作中經(jīng)常遇到血中嗎啡的檢測,常見的提取分離方法是液液提取法和固相萃取法,常見的檢測方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法等[3-4]。

本文以嗎啡為模板分子,甲基丙烯酸(MAA)為功能單體,乙二醇雙甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑,偶氮二異丁腈(AIBN)為自由基引發(fā)劑,在熱聚合條件下合成了分子印跡聚合物并對合成實驗條件進行了優(yōu)化選擇,研究了聚合物的吸附性和選擇性,利用自己合成的以嗎啡為印跡分子的高選擇性吸附材料(MIP)作為固相萃取材料對血中嗎啡進行了提取分離,利用衍生化氣相色譜法進行測定,提高了方法的靈敏度。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器條件及試劑

1.1.1 實驗儀器

D-7000型日立液相色譜儀;L-7610日立紫外檢測器,檢測波長為220nm;Anglient7890型氣相色譜儀,配氮磷檢測器。

1.1.2 色譜條件

色譜柱:DM-5熔融石英毛細管柱(30m×0.32 mm×0.25μm)。柱溫:200℃(1 min)—20℃/min—280℃(5min)。檢測器溫度:320℃。氣化室溫度:260℃。載氣高純氮,流量:2.0m L/min;不分流進樣(閥關(guān)閉 1min)。

1.1.3 試劑

甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)均為分析純(ACROS公司),使用前 MAA和 EDMA減壓蒸餾以除去阻聚劑;偶氮二異丁腈(AIBN,分析純);乙腈、甲醇、乙酸、乙酸乙酯均為色譜純;水(純凈水);安定、鹽酸嗎啡、鹽酸可待因、海洛因(購于國家麻醉品實驗中心);空白人血(購于沈陽市中心血站,含抗凝劑);N,N-三甲硅烷基三氟乙酸酐(BSTFA),購于美國 Sigma公司。

1.2 嗎啡分子印跡聚合物的合成

1.2.1 合成實驗條件優(yōu)化

為了考察模板、制孔劑及模板、單體、交聯(lián)劑間的配比對印跡聚合物親和性和選擇性的影響,制備了 20種聚合物,其預(yù)聚合混合物組成見表1和表2。

表1 不同配比的甲醇和水致孔劑合成的嗎啡分子印跡聚合物

表2 不同配比的模板與功能單體合成的嗎啡分子印跡聚合物

1.2.2 聚合物合成

稱取 0.1mmol模板分子于含有 1mL致孔劑的5mL試管中,然后加入一定量的功能單體(甲基丙烯酸,MAA)超聲 15 min,再加入交聯(lián)劑(乙二醇二甲基丙烯酸酯,EDMA)、4.0 mg偶氮二異丁腈(AIBN),超聲 15min,使偶氮二異丁腈溶解,通氮氣10min,然后將此溶液加入到一端已經(jīng)用死柱頭封閉好的 5 cm色譜柱中,滴加滿后,密封色譜柱,置于55℃(恒溫)水浴聚合 16h。

非印跡聚合物(NIP)在無模板分子存在的條件下用同樣的合成條件制備。

1.3 嗎啡分子印跡聚合物選擇性實驗測定

以合成的嗎啡分子印跡整體柱作為液相色譜柱,首先用乙腈:乙酸 (V/V,9∶1)的流動相充分淋洗,以洗除聚合物中的印跡分子、致孔劑等物質(zhì),然后進行高效液相色譜分析,以乙腈∶乙酸(V/V,100∶1)做流動相,流速為 1.0mL/m in,濃度為 1 mg/mL的嗎啡甲醇溶液進樣檢測,通過印跡分子在整體柱中的保留情況即保留時間以考察分析印跡柱對模板分子的選擇吸附效果,在同樣條件下,如果分析物在印跡整體柱中保留時間長,說明該印跡柱對分析物分子選擇性吸附好。同時在該條件下對與嗎啡分子結(jié)構(gòu)相似的可待因、海洛因進樣檢測,以考察分析印跡柱對與摸板分子結(jié)構(gòu)相近的非模板分子的吸附效果,考察分子印跡柱的選擇性吸附性能。

1.4 固相萃取應(yīng)用

1.4.1 分子印跡固相萃取柱的制備及預(yù)處理

取上述合成的嗎啡分子印跡聚合物(顆粒狀)稱重,裝于一次性注射器中,上下分別裝有墊片,制作成 3個含有印跡聚合物為 558mg、767mg和 220 mg的固相萃取柱,備用。

取上述固相萃取柱,依次用 2 mL乙腈∶醋酸(V/V,7∶3)、5m L乙腈、甲醇和蒸餾水過柱 ,活化固相萃取柱。

1.4.2 血中嗎啡的分離提取

取空白血 1 mL,添加嗎啡 1μg,用水稀釋至 2 mL后過嗎啡分子印跡柱,4～5mL水淋洗,2m L甲醇淋洗,5mL乙腈:乙酸(V/V,7∶3)洗脫,洗脫液中加入 2.0μg安定(內(nèi)標物),然后 80℃恒溫甘油浴,N2揮干,加入 50μL乙酸乙酯、20μLBSTFA,密封,60℃衍生化反應(yīng) 30min,N2氣流下吹干,加入 0.1 m L乙酸乙酯溶解,備檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 致孔劑的優(yōu)化選擇

[5]和[6],考慮到本文主要是用嗎啡分子印跡聚合物做固相萃取的現(xiàn)實需要性,又借鑒自然界許多分子識別系統(tǒng)如酶與底物、抗體與抗原、給體與受體等大多是在水環(huán)境中進行的,因而探討在水環(huán)境中制備和能在水環(huán)境中識別的 MIPs具有重要的科學意義和實用價值。使用不同配比的甲醇和水溶液合成聚合物,表征結(jié)果表明在 MIP1聚合物是黏稠液體,沒有聚合,隨著甲醇比例的增大,聚合物在分離效果方面有很大的改善。表征 MIP3聚合物時,在合適的洗脫條件下,嗎啡分子的吸附、洗脫有很好的效果。這可能是由于甲醇和水這個水相體系對嗎啡有較好的溶解性,甲醇和水的比在 8∶1及其他綜合條件下與嗎啡共同競爭功能單體能達到一個良性平衡狀態(tài),因而合成效果比較理想。

圖1 甲醇與水比例為 8∶1時的嗎啡分子印跡聚合物高效液相吸附色譜圖

2.2 功能單體和模板分子比例的優(yōu)化選擇

參考文獻[7]～[9],功能單體和模板分子的比例一般為 4∶1或 2∶1。此時功能單體和模板分子的結(jié)合量最大,但太大反而增加了非特異性吸附,不利于 MIP的高選擇性。本文采用前面的實驗方法分別合成了 2∶1,4∶1,6∶1,8∶1,9∶1的功能單體和模板分子的嗎啡分子印跡聚合物。實驗結(jié)果表明,隨著功能單體比例的增大,MIP的選擇性增強。這可能是由于嗎啡分子比較大,1個分子里含有兩個羥基,1個分子能和功能單體作用的識別位點較多。所以需要功能單體的量比較多,當比例達到 8∶1時合成的 MIP和 9∶1時合成的 MIP選擇性幾乎一樣,從節(jié)省功能單體的用量和減少非特異性吸附的角度考慮,本文采用 8∶1的比例合成的 MIP,結(jié)果也符合文獻報道,模板分子作用位點越多,需要的功能單體的比例越大。

2.3 嗎啡分子印跡聚合物選擇性能表征

以合成的嗎啡整體柱為液相色譜柱,選用質(zhì)量濃度為 1mg/m L的嗎啡、可待因、海洛因甲醇溶液進樣檢測,3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如圖2。分析印跡柱對模板分子和非模板分子的吸附效果。

由圖3可以看出,嗎啡分子印跡整體柱對海洛因幾乎沒有特異性保留,與甲醇溶劑峰沒有分開,出峰時間與嗎啡差別很大。這說明它與印跡聚合物的作用力可能只是非特異性吸附,印跡聚合物對嗎啡分子有選擇性和保留性,嗎啡分子印跡整體柱對可待因有保留,因為嗎啡和可待因的分子結(jié)構(gòu)有相似之處,印跡技術(shù)是靠“記住”分子的空間結(jié)構(gòu)來識別的[10]。嗎啡有 2個識別位點,而這 2個識別位點與甲基丙烯酸作用而形成具有特定結(jié)構(gòu)的識別性空穴,說明嗎啡分子印跡聚合物對嗎啡有較高的親和性和選擇性。

圖2 三種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式:(a)嗎啡;(b)可待因;(c)海洛因

圖3 不同物質(zhì)過嗎啡分子印跡柱的液相色譜圖

2.4 固相萃取應(yīng)用

2.4.1 色譜條件考察

圖4為空白血經(jīng) MIP柱萃取后,萃取液中加入內(nèi)標物,濃縮后經(jīng) TMS衍生化后所的色譜圖,圖5為空白血添加 1μg嗎啡經(jīng) MIP柱萃取后,萃取液中加入內(nèi)標物,濃縮后經(jīng) TMS衍生化后所的色譜圖。從圖中可見,嗎啡衍生化產(chǎn)物和內(nèi)標物能夠完全分離,且無雜質(zhì)干擾,說明 MIP固相萃取法分離血中嗎啡具有較高的選擇性。

圖4 1m L空白血經(jīng)M IP柱萃取后加入內(nèi)標物經(jīng)TMS衍生化后所得色譜圖

圖5 添加 1μg嗎啡的 1m L血經(jīng) M IP柱萃取后加入內(nèi)標物經(jīng)TMS衍生化后所得色譜圖

2.4.2 血中嗎啡的工作曲線

取空白血液 2mL(21份),每 3份為一組,分別加入嗎啡 0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg,混勻后分別過嗎啡分子印跡柱。印跡柱依次用 5mL水和甲醇淋洗,用乙腈∶醋酸(V/V,7∶3)1mL洗脫,洗脫液中添加 2.0μg安定,80℃甘油浴,N2流下?lián)]干;然后加入 50μL乙酸乙酯和 20μL BSTFA,密封60℃反應(yīng) 30min,N2流下?lián)]干;加入 0.1mL乙酸乙酯溶解,進行氣相色譜分析。

從所得色譜圖中計算各分析物與內(nèi)標物的色譜峰面積比,用峰面積比(y)為縱坐標,檢材中分析物質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標,進行線性回歸,得出內(nèi)標回歸線性方程,并計算出相關(guān)系數(shù) γ。線性方程為 :y=0.085 4x-0.0121,γ=0.997 8。

2.4.3 血中嗎啡的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

首先取空白檢材按上述的優(yōu)化分析方法進行分析,測定被分析物色譜峰處的基線噪聲強度與內(nèi)標物色譜峰高之比,然后取空白檢材添加比預(yù)計檢測限略高濃度的分析物進行分析,測定分析物色譜峰高與內(nèi)標物色譜峰高之比。根據(jù)分析物色譜峰處噪聲強度的 3倍與內(nèi)標物色譜峰峰高比和空白添加樣品中分析物色譜峰與內(nèi)標物色譜峰峰高比值之比計算確定方法的檢出限,同理根據(jù)分析物色譜峰處噪聲強度的 10倍與內(nèi)標物色譜峰峰高比和空白添加樣品中分析物色譜峰與內(nèi)標物色譜峰峰高比值之比確定方法的定量限。經(jīng)測定血中嗎啡的檢出限為0.067μg/mL,定量限為 0.207μg/m L。

2.4.4 回收率、準確性和精密度的考察

本實驗在線性范圍內(nèi)進行了準確性和精密度的考察,以及日間(批間)精密度的考察。

取血液(1m L)7份,加入嗎啡 2.0μg和內(nèi)標安定 1.0μg,用優(yōu)選的萃取方法進行萃取和測定,并從相應(yīng)的工作曲線計算嗎啡的測值,測值與添加值之比為回收率,平行測定 7次,計算回收率的平均值及變異系數(shù) RSD。結(jié)果表明,日間回收率及相對標準差為 69.8%±9.5%。

3 結(jié)論

以嗎啡為模板分子,α-甲基丙烯酸(MAA)為功能單體,偶氮異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑,乙二醇雙甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑,制備合成了嗎啡分子印跡整體柱。該整體柱對嗎啡具有很好的選擇特異性吸附。該制備方法操作簡單方便,合成的聚合物整體柱作為固相萃取材料,在對血中的嗎啡凈化和提取方面有很大的提高,為公安系統(tǒng)進行嗎啡分析檢測提供了一種較好的參考方法。

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