陳楚淘，田浩梅，嚴 潔，張英進，姚 雯，易受鄉(xiāng)*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410007；湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院經(jīng)穴臟腑相關(guān)重點研究室，湖南 長沙 410007）

本課題組前期研究通過蛋白芯片技術(shù)從720種已知蛋白中快速篩選磷酸化水平發(fā)生改變的蛋白，綜合分析發(fā)現(xiàn)以絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的蛋白磷酸化的水平改變最為明顯，其中以RAF-1蛋白的表達上調(diào)量最明顯，故進一步選用分子生物方法加以分析，確定與胃黏膜修復(fù)有關(guān)的信號蛋白種類，闡明電針足陽明胃經(jīng)促胃黏膜修復(fù)的部分作用機制?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，共40只，由上海必凱爾實驗動物中心提供,許可證號sdxk(滬)2003-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗前適應(yīng)環(huán)境1周，控制室溫20～22℃，相對濕度65%～70%。動物實驗于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心和國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室、經(jīng)穴與臟腑相關(guān)重點研究室完成。

1.1.2 儀器 酶標儀 （Thermo）；電泳儀 （北京六一儀器廠）；電泳、轉(zhuǎn)移裝置（BIO-RAD）；磁力攪拌器（太倉華美生化儀器廠）；脫色搖床（興化化儀器廠）；反應(yīng)容器（上?？党缮镉邢薰荆?；G6805-2型電針儀。

1.1.3 試劑 磷酸化RAF-1抗體（CST公司）；細胞及組織總蛋白抽提試劑盒 （KangChen，KC-415）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（KangChen，KC-430）；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、20%SDS（w/v）、Tris-Cl 1.0 M pH 8.8、Tris-Cl 1.0 M pH 6.8、10%APS、TEMED、生物素的標記的蛋白分子量標準（KangChen，KC-410）、 甘氨酸、β 巰基乙醇溴酚藍、10×電泳緩沖液（Tris堿 30.3 g，甘油 144 g，SDS 10 g，雙蒸水調(diào)至體積為1 L）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 動物編號并隨機分為4組，每組10只。A組：空白組；B組：模型組；C組：針刺治療組；D組：針刺對照組。

1.2.2 動物造模 參照無水乙醇灌胃法[1]制作大鼠胃黏膜損傷模型，除空白組外，其余造模大鼠均禁食不禁水24 h，24 h后行無水乙醇灌胃，先用普通注射針頭，按灌胃乙醇劑量為0.8 mL/100 g吸取相應(yīng)劑量，再接上普通大鼠灌胃針頭，按一般的灌胃方法將無水乙醇灌胃1次，同時恢復(fù)普通飲食,根據(jù)預(yù)試實驗結(jié)果，24 h后造模大鼠胃黏膜可充血水腫，出現(xiàn)點狀或線狀的出血點，提示造模成功。

1.2.3 穴位定位 參考林文注主編[2]《實驗針灸學(xué)》常用動物穴位定位法及擬人對照法定位。足三里：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處；梁門：腹正中線與鎖骨中線之間的中線上，臍[3]（根據(jù)類比原理，在大鼠胸腹正中線，胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4與下1/4交界處）上4寸；四白：眶下緣正中；非穴對照點：與足三里穴、梁門、四白穴內(nèi)側(cè)旁開約0.3 cm的非經(jīng)非穴點。

1.2.4 針刺方法 取大鼠雙側(cè)足三里、梁門穴、四白穴或非穴對照點，1次/d，連續(xù)7 d。大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺相應(yīng)的穴位和對照點后，固定針刺深度，接上G6805-2型電針儀，電針波形為疏密波，疏波4HZ，密波50HZ，脈沖寬度0.5 ms，輸出電壓2～4 V，強度以大鼠的肢體輕顫為度，電針時間30 min，連續(xù)7 d。實驗動物常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機挑選10只為空白組，其余30只大鼠成模后再將大鼠隨機分為3組：模型組、針刺治療組與針刺對照組。

空白組及模型組：每日純束縛于鼠板上30 min，不做其它處理，每日實驗1次，共7 d。針刺治療組：大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺雙側(cè)足三里、梁門、四白穴，然后于足三里穴和梁門穴接上電針，共兩對電針，同側(cè)足三里穴和梁門穴與同一對電針相連，正極接足三里穴，負極接梁門穴，電針時間30 min，電針參數(shù)參考針刺方法，連續(xù)7 d。針刺對照組：大鼠仰臥位束縛于鼠板上，針刺雙側(cè)足三里、梁門、四白穴的內(nèi)側(cè)約0.3 cm的非經(jīng)非穴點處，然后于足三里穴和梁門穴的對照點接上電針，共兩對電針，同側(cè)足三里穴和梁門穴的對照點與同一對電針相連，正極接足三里穴對照點，負極接梁門穴對照點，電針時間30 min，電針參數(shù)參考針刺方法，連續(xù)7 d。

1.2.6 胃黏膜標本制備 7 d所有大鼠處理后取材，迅速切開大鼠腹部，取出整胃，用4℃的生理鹽水沖洗胃的表面，隨機每份挑選5只將胃沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗干凈，行胃黏膜損傷指數(shù)計數(shù)，剩余5只將胃反轉(zhuǎn)，行胃黏膜損傷指數(shù)計數(shù)，參照本課題組前期的報道[4]，采用鏈霉蛋白酶消化法提取胃黏膜細胞，行免疫印跡檢測。

1.2.7 胃黏膜損傷指數(shù)計數(shù) 參照GUTH法檢測潰瘍指數(shù)。全胃各病灶長度之和為損傷指數(shù)，以mm表示。損傷≤1 mm（包括糜爛點）為1分；1 mm＜損傷≤2 mm為2分；2 mm＜損傷≤3 mm為3分；3 mm＜損傷≤4 mm為4分；＞4 mm為5分；損傷寬度＞2 mm者UI加倍。

1.2.8 P-RAF-1檢測方法 取胃黏膜細胞提取總蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳,采用半干法轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜分別浸入含10%脫脂奶粉TBST的封閉液 (室溫封閉l h)、TBS配制一抗稀釋液，4℃過夜、HRP標記的二抗稀釋液，室溫2 h。最后將膜置于X光片盒中，曝光2～4 min，顯影40 s，定影2 min，水洗5 min。 每一步驟注意充分水洗，避免非特異性染色。圖片掃描保存為電腦文件，并用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化計算出相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電針足陽明經(jīng)(穴)對大鼠胃黏膜損傷指數(shù)的影響

（1）與空白組比較，模型組胃黏膜損傷指數(shù)值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功；（2）針刺治療組胃黏膜損傷指數(shù)值顯著低于模型組和針刺對照組(P<0.01)，提示電針足三里、梁門、四白穴可減輕無水乙醇灌胃造成的胃黏膜損傷，對胃黏膜具有修復(fù)作用，且存在穴位特異性。結(jié)果見表1。

表1 對大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較 （±s）

表1 對大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較 （±s）

注：與空白組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.01；與針刺對照組比較▼P<0.01。

組 別空白組模型組針刺對照組針刺治療組n 10 10 10 10 UI 5.60±2.84 14.40±5.58*13.20±3.79*7.00±2.94△▼

2.2 電針足陽明經(jīng)(穴)對大鼠胃黏膜PCNA的影響

（1）與空白組比較，模型組胃黏膜PCNA-LI明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05)；（2）與模型組比較，針刺治療組與針刺對照組的胃黏膜PCNA-LI明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01和P<0.05)；（3）與針刺對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但針刺治療組PCNA-LI高于針刺對照組，結(jié)果提示應(yīng)激造模后，胃黏膜增殖能力下降，電針“四白”、“梁門”、“足三里”穴可促進胃黏膜損傷后的細胞增殖修復(fù)，且針刺治療組效果優(yōu)于針刺對照組。結(jié)果見表2。

表2 電針足陽明經(jīng)（穴）對胃黏膜受損大鼠胃黏膜PCNA-LI的影響 （±s，個/μm2）

表2 電針足陽明經(jīng)（穴）對胃黏膜受損大鼠胃黏膜PCNA-LI的影響 （±s，個/μm2）

注：與空白組比較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

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3.3 電針足陽明胃經(jīng)（穴）對大鼠胃黏膜細胞RAF-1磷酸化水平的影響

因模型組與針刺對照組各有一例樣本蛋白量不夠而被剔除。（1）與空白組比，模型組的RAF-1磷酸化水平檢測值顯著降低 （P<0.05），說明大鼠的胃黏膜受損抑制了RAF-1磷酸化；（2）與空白組比，針刺治療組RAF-1磷酸化水平檢測值顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而針刺對照組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明了穴位的特異性；（3）與模型組比較，針刺治療組RAF-1磷酸化水平檢測值升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），針刺對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示電針后兩組的RAF-1磷酸化水平均得到了提高；（4）針刺治療組與針刺對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05），提示針刺對照組誘發(fā)RAF-1磷酸化的作用不及針刺治療組，表明針刺 “足三里”“四白”、“梁門”穴在促胃黏膜修復(fù)的過程中與RAF-1蛋白磷酸化有關(guān)。結(jié)果見表3、圖1。

表3 電針足陽明胃經(jīng)（穴）對大鼠胃黏膜細胞RAF-1磷酸化水平的影響 （±s）

表3 電針足陽明胃經(jīng)（穴）對大鼠胃黏膜細胞RAF-1磷酸化水平的影響 （±s）

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與針刺對照組比較▼P<0.05。

組 別空白組模型組針刺對照組針刺治療組n5445 P-RAF-1 相對密度值（p-RAF-1/β-actin）0.934±0.045 0.814±0.119*0.971±0.079△1.119±0.053**△△▼

3 討論

蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動的整個過程，尤其在細胞應(yīng)答外界刺激的信號傳遞途徑中，蛋白質(zhì)磷酸化是目前所知道的最主要方式[5-6]，Raf家族是都具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)[7-9]，Raf-1能否被磷酸化，能否被激活、是否能夠準確地下傳信號對于細胞是否出現(xiàn)增效應(yīng)至關(guān)重要[9]。

raf是一種原癌基因，其家族中包括A-raf，B-raf和C-raf-1 （c-raf，raf-1），Raf家族是都具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)[7-8]。C-Raf-1是由648個氨基酸組成，位于3號染色體3P25，是分子量為74 KDa的細胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,活化后具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性。raf-1在生理的情況下可以激活MEK1和MEK2，MEK1/MEK2激活后，可以磷酸化一系列的胞漿蛋白[8]。此通路的活化主要引起細胞的有絲分裂及活化。Raf-1能否被激活、是否能夠準確地下傳信號對于細胞是否出現(xiàn)增效應(yīng)至關(guān)重要[9]。raf-1與ERK1/2實際上為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中c-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分[10-14]。c-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是諸多信號途徑中與細胞增殖、分化密切相關(guān)的最重要信號通路之一。通過特定的絲/蘇氨酸殘基的磷酸化c-Raf.MEK.ERK1/2蛋白可被依次活化，參與調(diào)控細胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生理功能。

胃黏膜細胞增殖能力是影響潰瘍愈合的重要因素，PCNA在細胞增殖和DNA合成過程中也起重要作用，是目前較常用的評價細胞增殖的指標。唐志鵬等[1]在對實驗性胃潰瘍大鼠進行的研究中發(fā)現(xiàn)，再生黏膜的腺體底部細胞增殖增多，潰瘍邊緣黏膜的細胞增殖帶位置上移，而且PCNA標記的增殖指數(shù)增加。Kitajima等[15]運用免疫組織化學(xué)染色檢測PCNA以反映乙酸誘發(fā)大鼠胃潰瘍的細胞增殖動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)在建立潰瘍后PCNA標記指數(shù)增加，潰瘍邊緣黏膜細胞增殖活性增強,易受鄉(xiāng)等[16]發(fā)現(xiàn)預(yù)先艾灸足三里、梁門穴可顯著增加胃黏膜增殖指數(shù)促胃黏膜修復(fù)。

本實驗結(jié)果提示，大鼠無水乙醇灌胃形成胃黏膜損傷以后，模型大鼠的RAF-1蛋白磷酸化水平下調(diào)，電針“足三里”、“四白”、“梁門”穴后，RAF-1 蛋白磷酸化水平的量顯著升高，且胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低，提示胃黏膜損傷修復(fù)實現(xiàn)。針刺對照組的RAF-1蛋白磷酸化水平雖與模型組有差異，表現(xiàn)為一定程度的上調(diào)，稍高于模型組，與空白組差異不明顯，但對照組的胃黏膜損傷指數(shù)與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義提示，針刺對照點并不能明顯改善受損的胃黏膜，可能只與一方面對照點的效應(yīng)有關(guān)，另一方面不排除電針的電流效應(yīng)。同時本實驗結(jié)果還顯示與空白組比較，無水乙醇灌胃造模后，胃黏膜PCNA的量明顯減少，提示模型組的細胞增殖被抑制，而電針足陽明胃經(jīng)后，胃黏膜PCNA顯著得到上調(diào)，提示電針足陽明胃經(jīng) （穴）可促胃黏膜細胞增殖。從而說明RAF-1蛋白的磷酸化促胃黏膜細胞增殖，參與了胃黏膜損傷修復(fù)的過程。

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