王 萍,李虹偉,王宇朋,張 盼,陳 暉,馬文英

松弛素(relaxin,RLX)是1926年 Hisaw從懷孕的豬黃體細胞中提取出的妊娠相關(guān)激素。生物體內(nèi)多種組織細胞均可以合成和分泌RLX,黃體和前列腺是RLX生成的主要部位。非生殖系統(tǒng),如大腦、胃腸道及心房、心室[1]也發(fā)現(xiàn)有RLX、RLX前體或RLX樣活性物質(zhì)的存在。近年大量實驗資料顯示:RLX對多種組織器官(包括心臟)的纖維化都具有防治作用,可能是機體內(nèi)源性抗纖維化因子。RLX能夠抑制高血壓大鼠的心肌纖維化;形成心肌纖維化的β2腎上腺素受體轉(zhuǎn)基因小鼠[1],接受RLX治療 2周,成纖維細胞的增殖顯著受到抑制,心臟膠原含量顯著下降。RLX能夠抑制受前纖維化因子,如血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用的心臟成纖維細胞的增殖和活化。RLX拮抗心肌纖維化有一定的優(yōu)點:起效迅速;劑量依賴;對正常組織沒有影響。

近年來大量研究發(fā)現(xiàn),獨立于高血壓、冠心病和其他心臟基礎(chǔ)疾病外,糖尿病導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變。即使不同時存在高血壓、動脈粥樣硬化,糖尿病患者心力衰竭的發(fā)生率較高[2,3]。此外,糖尿病是多種心臟病的高危因素,而且如果心臟基礎(chǔ)病合并糖尿病,其預(yù)后更差。糖尿病動物發(fā)生心肌梗死后生存率更低,左室重塑及心肌纖維化、心肌細胞的凋亡更嚴重[4,5]。心肌纖維化是導(dǎo)致糖尿病心臟損害的主要病理過程之一,心肌纖維化表現(xiàn)為膠原大量沉積,增加了心室壁的僵硬度,降低了心室順應(yīng)性,導(dǎo)致心室收縮及舒張功能不全。

高血糖是糖尿病的主要病理表現(xiàn)。高血糖本身及其上調(diào)前纖維化因子-AngⅡ[6,7],轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)[8]等的表達都可以導(dǎo)致心臟成纖維細胞數(shù)目和心肌間質(zhì)膠原成分的增多,即導(dǎo)致心肌纖維化。筆者推論,重組人松弛素(recombinant human relaxin,rhRLX)能夠抑制或延緩、逆轉(zhuǎn)高血糖引起的心肌纖維化。為了證實這一推論,本研究進行相關(guān)的體外實驗。此外,在心血管病理狀態(tài)下,心臟也有RLX的表達和釋放。已有研究顯示,心力衰竭患者血漿和心臟局部 RLX表達增加,并且和心力衰竭的程度呈正相關(guān)[9]。自發(fā)性高血壓大鼠心臟RLXmRNA和蛋白水平顯著升高[10]。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血損傷模型中,心臟和血漿中RLX水平明顯升高[11]。這些研究結(jié)果提示在病理條件下,RLX的表達發(fā)生變化。因此,本研究額外觀察高血糖是否可以導(dǎo)致RLX表達的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 出生1～3d的Sprague-Dawley大鼠,雌雄不限,由維通利華實驗動物技術(shù)公司提供;rhRLX購自美國R﹠D公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;T rizol Reagen購自美國Invitrogen公司;抗鼠波形蛋白單克隆一抗、即用型 SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶購自美國Amresco公司;引物由北京奧科生物公司合成和純化。

1.2 實驗方法 (1)心臟成纖維細胞的分離和培養(yǎng):在無菌條件下取乳鼠心臟,用0.25%的胰酶消化心肌組織,差速貼壁60 min,獲得心臟成纖維細胞,用含DMEM+10%胎牛血清+谷胺酰胺+雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)心臟成纖維細胞。通過細胞形態(tài)學(xué)和波形蛋白免疫組化染色鑒定心臟成纖維細胞,心臟成纖維細胞的純度為95%。傳代細胞用0.125%胰酶消化。以二代至四代心臟成纖維細胞為研究對象。(2)實驗分組:正常糖(normal glucose,NG)組:DMEM內(nèi)含5.6 mmol/L D-葡萄糖的DMEM。NG+rhRLX組:DMEM 內(nèi)含5.6 mmol/L D-葡萄糖+100 μ g/L的rhRLX。高糖(high glucose,HG)組:DMEM 內(nèi)含25 mmol/L D-葡萄糖。HG+rhRLX組:DMEM內(nèi)含25 mmol/L D-葡萄糖+100 μ g/L的rhRLX。OSM組:DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含5.6 mmol/L D-葡萄糖+19.4 mmol/L甘露糖。(3)RT-PCR:①RT-PCR步驟:提取總RNA。紫外分光法確定RNA的量和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈cDNA。mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA程序:37℃保溫60 min,95℃5 min,以滅活反轉(zhuǎn)錄酶,4℃1～5 min,可迅速放入-80℃長期凍存。RTPCR 體系 :cDNA 2 μ l;10 ×Buffer 2.5 μ l;dNTPs(10 mmol/L)0.5 μ l;正向引物(20 μ mol/L)0.25 μ l;反向引物(20 μ mol/L)0.25 μ l;Taq 酶(2 ×106U/L)0.5 μ l;ddH2O 19 μ l。所有RT-PCR的擴增體系相同。②引物序列:β-actin引物序列(349bp):正向引物:GAAATCGTGCGTGACATTA;反向引物:TAGGAGCCAGGGCAGTAA。Pro-collagenⅠ引物序列(196bp):正向引物 5'-T TCACCTACAGCACGCTTGT-3';反向引物:5'-T TGGGATGGAGGGAGT TTAC-3'。Pro-collagenⅢ引物序列(201bp):正向引物 F5'-T TGAATA TCAAACACGCAAGGC-3';反 向 引 物 5'-GGTCACT T T CACTGGT TGACGA-3'。relaxin-1引物序列(213bp):正向引物5'-CGT TGAGCGATTCCGT TGT-3';反向引物 R5'-CTCCGTATCAGCAGAGTT TAGC-3'。

取 PCR擴增產(chǎn)物10 μ l置于1.5%瓊脂糖中電泳(電壓80 V,電流40 mA,電泳時間60 min)。將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于紫外成像掃描儀上觀察并照相。用圖像分析軟件進行分析,分別用Procollagen Ⅰ/β-actin、Pro-collagenⅢ/β-actin 、RLX-1/β-actin灰度值表示mRNA的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。所有計量資料數(shù)據(jù)以±s表示。多組資料比較采用方差分析(one-way ANOVA),組間差異用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 mRNA表達結(jié)果

如圖1和圖2所示,與NG組比較,HG組Ⅰ型前膠原mRNA和Ⅲ型前膠原mRNA的表達均明顯增加(P＜0.01);OSM組和NG組與HG組比較,Ⅰ型前膠原mRNA的表達和Ⅲ型前膠原 mRNA均沒有明顯差別(P＞0.05);HG+rhRLX組Ⅰ型前膠原mRNA和Ⅲ型前膠原mRNA的表達均明顯減少(P＜0.01)。

如圖3和表1所示,HG組RLX-1 mRNA的表達明顯強于NG組(P＞0.05)。

3 討 論

心臟成纖維細胞是一種在細胞外基質(zhì)內(nèi)能自由移動的多潛能細胞,能合成膠原等細胞外基質(zhì)成分,心臟成纖維細胞的增殖和(或)膠原蛋白合成分泌的“過度”增加是纖維化發(fā)生的細胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

圖3 各組RLX-1 mRNA的電泳圖(n=3)

在心肌細胞外間質(zhì)中,Ⅰ型和Ⅲ型膠原占主要部分。Ⅰ型膠原占膠原總量的85%,具有較大張力,但伸展回縮性小,主要聚合成粗纖維網(wǎng),其多少決定著心臟的僵硬度;Ⅲ型膠原占11%,具有較大伸展回彈性,主要形成細纖維網(wǎng),與室壁彈性有關(guān)。它們的適當比值對維持心肌組織結(jié)構(gòu)及心臟功能的完整性具有重要意義。心肌膠原合成分為細胞內(nèi)前膠原合成和細胞外前膠原轉(zhuǎn)化聚合成膠原纖維的兩個階段,前膠原需在蛋白水解酶的作用下裂解氨基和羧基末端才能發(fā)生構(gòu)型改變,形成膠原纖維的相互交聯(lián)和三螺旋結(jié)構(gòu)。大多數(shù)研究都發(fā)現(xiàn)高糖增加Ⅰ型膠原的合成[12],對Ⅲ型膠原的研究較少。本研究觀察高糖對Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原合成的影響。HG組Ⅰ型前膠原mRNA的表達明顯高于NG組,HG組Ⅲ型前膠原mRNA表達明顯高于NG組。提示高糖增加成纖維細胞內(nèi)Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的表達,此外,高糖對Ⅰ型膠原纖維形成的促進作用比對Ⅲ型膠原纖維形成的促進作用強。本研究結(jié)果表明,OSM組Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的表達與NG組比較沒有差異,這說明高糖促進的Ⅰ型和Ⅲ型前膠原的表達是由于高糖濃度導(dǎo)致的,而不是高滲透壓引起的。

本研究中NG+rhRLX組Ⅰ型前膠原 mRNA和Ⅲ型前膠原mRNA的表達都比NG組明顯,提示在轉(zhuǎn)錄水平100 μ g/L rhRLX可能是促進前膠原的表達;另外,有研究顯示給予低劑量rhRLX(使血清濃度維持20 μ g/L)的雌性和雄性大鼠心輸出量增加和外周血管阻力降低,但高劑量rhRLX(血清濃度達80 μ g/L)不改變動物心輸出量和外周血管阻力,表明血管對 rhRLX呈劑量依賴的雙向反應(yīng)[12,13]。雌性大鼠妊娠期間RLX的血濃度是50～100 μ g/L,本研究中 rhRLX 的作用濃度是100 μ g/L,其他濃度的rhRLX可能抑制Ⅰ型前膠原mRNA和Ⅲ型前膠原mRNA的表達。此外,rhRLX能夠完全抑制高糖引起的Ⅲ型前膠原mRNA的表達上調(diào),但不能完全抑制高糖引起的Ⅰ型前膠原mRNA的表達上調(diào)調(diào)。這提示高糖對不同類型膠原合成的促進作用是通過不同機制實現(xiàn)的,rhRLX對高糖環(huán)境促進Ⅲ型膠原表達的機制能夠完全拮抗。在Samuel等[1]的研究中,未發(fā)現(xiàn)乳鼠心臟成纖維細胞RLX-1 mRNA的表達。本研究發(fā)現(xiàn),NG環(huán)境下培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細胞RLX-1 mRNA的表達很微弱。HG促進心臟成纖維細胞RLX-1 mRNA的表達,提示在一定的病理條件下(糖尿病)心臟成纖維細胞能夠產(chǎn)生RLX。

表1 各組Pro-collagenⅠ,Pro-collagenⅢ,RLX-1 mRNA的比較(n=3)

結(jié)論:人rhRLX能夠抑制高糖環(huán)境下心臟成纖維細胞膠原的合成。高糖能夠促進內(nèi)源性RLX的表達。

[1]Samuel CS,Unemori EN,Mookerjee I,et al.Relaxin modulates cardiac fibroblast proliferation,differentiation,and collagen production and reverses cardiac fibrosis in vivo[J].Endocrinology,2004,145(9):4125-4133.

[2]Hamby RI,Zoneraich S,Sherman L.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749-1754.

[3]Wold LE,Relling DP,Colligan PB,et al.Characterization of contractile function in diabetic hypertensive cardiomyopathy in adult rat ventricular myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33(9):1719-1726.

[4]Shiomi T,Tsutsui H,Ikeuchi M,et al.Streptozotocin-induced hyperglycemia exacerbates left ventricular remodeling and failure after experimental myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol,2003,42(1):165-172.

[5]Backlund T,Palojoki E,Saraste A,et al.Sustained cardiomyocyte apoptosis and left ventricular remodelling after myocardial infarction in experimental diabetes[J].Diabetologia,2004,47(2):325-330.

[6]Fiordaliso F,Li B,Latini R,et al.Myocyte death in streptozotocin-induced diabetes in ratsin angiotensin II-dependent[J].Lab Invest,2000,80(4):513-527.

[7]Asbun J,Manso AM,Villarreal FJ.Profibrotic influence of high glucose concentration on cardiac fibroblast functions:effects of losartan and vitamin E[J].Am J PhysiolHeart Circ Physiol, 2005, 288(1):H227-H234.

[8]Way KJ,Isshiki K,Suzuma K,et al.Expression of connective tissue growth factor is increased in injured myocardium associated with protein kinase C beta 2 activation and diabetes[J].Diabetes,2002,51(9):2709-2718.

[9]Dschietzig T,Richter C,Bartsch C,et al.The pregnancy hormone relaxin is a player in human heart failure[J].FASEB J,2001,15(12):2187-2195.

[10]Lekgabe ED,Kiriazis H,Zhao C,et al.Relaxin reverses cardiac and renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats[J].Hypertension,2005,46(2):412-418.

[11]Zhang J,Qi YF,Geng B,et al.Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol[J].Peptides,2005,26(9):1632-1639.

[12]Debrah DO,Conrad KP,Danielson LA,et al.Effects of relaxin on systemic arterial hemodynamics and mechanical properties in conscious rats:sex dependency and dose response[J].J Appl Physiol,2005,98(3):1013-1020.

[13]Debrah DO,Conrad KP,Novak J,et al.Recombinant human relaxin(rhRLX)modifies systemic arterial properties in conscious rats irrespective of gender,but in a biphasic fashion[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1041:155-162.