周杰敏,任璐,劉慧平,韓巨才,王美琴

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801)

番茄早疫病菌對(duì)嘧菌酯的抗藥性誘導(dǎo)及突變體特性研究

周杰敏,任璐,劉慧平,韓巨才,王美琴

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801)

為了評(píng)價(jià)番茄早疫病菌Alternaria solina對(duì)嘧菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn),試驗(yàn)以敏感菌株為材料,通過室內(nèi)紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化的方法獲得了3株番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體,并比較了抗、感菌株之間的生物學(xué)特性。結(jié)果表明,突變體EC50值均大于200 μ g?mL-1,達(dá)到高水平抗性,且突變體抗藥性穩(wěn)定,經(jīng)無性繁殖10次,抗性不喪失。在無藥情況下,敏感菌株致病力較強(qiáng),葉片發(fā)病面積達(dá)到95%以上,而抗性菌株的發(fā)病面積僅為70%;在藥劑存在的情況下,敏感菌株生長被抑制,而抗性菌株致病面積達(dá)80%以上。突變體在生長速率較敏感菌株有所下降,產(chǎn)孢量及分生孢子萌發(fā)率與敏感菌株沒有顯著差異。突變體粗毒素對(duì)番茄種子萌發(fā)抑制率高于敏感菌株。孢子的競(jìng)爭(zhēng)能力明顯弱于敏感菌株。

番茄早疫病菌;嘧菌酯;抗性誘導(dǎo);生物學(xué)特性

番茄早疫病是由茄鏈格孢Alternariasolani引起的番茄重要病害之一,在我國黑龍江、河北、山西、山東、湖北、湖南、上海、江蘇、廣東和廣西等省都有發(fā)生。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可引起落葉、落果和斷枝,對(duì)番茄產(chǎn)量影響很大[1]。由于番茄早疫病具有潛育期短、再侵染頻繁、流行速率高的特點(diǎn)[2],長期使用單一藥劑防治,在藥劑的選擇壓力下病原菌容易形成抗藥性群體[3,4]。開發(fā)新型高效的殺菌劑來控制番茄早疫病的流行與危害已經(jīng)成為廣大農(nóng)業(yè)科技工作者面臨的重大課題。嘧菌酯azoxystrobin既能抑制菌絲生長又能抑制孢子萌發(fā),并且對(duì)真菌分生孢子產(chǎn)生也有顯著的抑制作用,具有鏟除、保護(hù)、內(nèi)吸及橫向輸導(dǎo)等特性,因其殺菌活性高、殺菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)、對(duì)非耙標(biāo)作物和從未使用過嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的作物安全且與環(huán)境有良好的相容性而被廣泛用于防治多種經(jīng)濟(jì)作物病害[5～7]。為對(duì)番茄早疫病菌嘧菌酯抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及抗性治理提供理論依據(jù),及了解抗性菌株的生物學(xué)特性,本文對(duì)番茄早疫病菌進(jìn)行了室內(nèi)抗性誘導(dǎo),并進(jìn)行了抗性菌株遺傳穩(wěn)定性,生長速率、產(chǎn)孢量、致病力、產(chǎn)毒量及競(jìng)爭(zhēng)力等的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種及材料供試菌種由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。番茄葉片采自山西省太谷縣楊家莊未噴施農(nóng)藥的大棚。

番茄品種:大紅908。

1.1.2 供試藥劑

供試殺菌劑。

25%嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑(先正達(dá)作物保護(hù)有限公司),以無菌水為溶劑,配制成質(zhì)量濃度為1.0×104mg?L-1的母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基,PD培養(yǎng)基,WA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 敏感基線的建立

根據(jù)范永玲得出的敏感基線結(jié)果[8]。為嘧菌酯的 EC50值在 0.0004～ 0.0678 μ g?mL-1,平均EC50值為 0.0331 μ g?mL-1,最低抑制濃度為 1.0 μ g?mL-1,以此作為番茄早疫病病菌對(duì)嘧菌酯殺菌劑的相對(duì)敏感基線。

1.2.2 抗藥性誘導(dǎo)

紫外線誘導(dǎo)。將生長5 d的敏感菌株S38和S42制成孢子懸浮液,涂布于含嘧菌酯100 μ g?mL-1的PDA平板中,紫外燈下(40W,15 cm)分別照射30 s、60 s、90 s、2 min 、5 min 、8 min,將照射后的平板迅速用牛皮紙包好放于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7～10 d。

藥劑馴化。在敏感菌株S38的菌落邊緣打取直徑為4 mm 的菌塊,接種于含嘧菌酯 500 μ g?mL-1的PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng)并觀察菌落形狀。

1.2.3 抗性水平測(cè)定

采用孢子懸滴法,設(shè)置嘧菌酯濃度為0.625、2、10 、20、50、100、200 μ g?mL-17 個(gè)梯度濃度 ,以不加藥者為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。將抗性突變

體R42-8,R42-2和R38-5培養(yǎng)5 d后,用0.5%的吐溫水制成孢子懸浮液。分別取10 μ L的孢子懸浮液和等體積的各濃度藥液分別混合均勻,滴在凹玻片上,25℃倒置保濕培養(yǎng)12 h后,顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況,計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.4 無藥繼代培養(yǎng)

將紫外誘導(dǎo)獲得的抗性突變體R42-2,R42-8在無藥PDA平板上25℃連續(xù)培養(yǎng)10次,每次培養(yǎng)3 d,分別測(cè)其第 1 、3、5、7、10 次的抗性水平。

1.2.5 致病力測(cè)定

采用離體葉片測(cè)定法,將新鮮的番茄葉片用直徑1.5 cm的打孔器打成大小均勻的葉碟,用無菌水沖洗表面后,在75%乙醇中浸泡1 min進(jìn)行表面消毒,然后再用無菌水漂洗,撈出瀝干置于滅菌培養(yǎng)皿中,每皿5片。配制4 μ g?mL-1嘧菌酯藥液,將瀝干葉片浸入藥液5 s拿出晾干,以浸入無菌水5 s晾干的葉碟為對(duì)照。分別將PDA平板上培養(yǎng)5 d的敏感菌株S38、S42和抗性菌株R42-2、R42-8的孢子懸浮液均勻噴灑在葉片表面,每處理重復(fù)三次,將滅菌培養(yǎng)皿在25℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)5 d后,對(duì)葉片進(jìn)行發(fā)病面積調(diào)查。用坐標(biāo)紙計(jì)算葉片發(fā)病面積,取平均值。

1.2.6 抗感菌株生長速率及產(chǎn)孢量比較

從各供試菌株距菌落邊緣相同位置取直徑為4 mm的菌塊接種于PDA平板上,25℃下黑暗培養(yǎng),分別測(cè)量生長 1、2、3、4、5 和 6 d 后的菌落直徑,另外用4 mm的打孔器取一菌塊,用20 mL加吐溫80的無菌水洗下孢子[9],充分振蕩后采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定生長6 d后的產(chǎn)孢量[10]。

1.2.7 突變體與敏感菌株孢子萌發(fā)力測(cè)定

將相同濃度的敏感菌株和突變體的孢子懸浮液(1×105孢子?mL-1)100 μ L均勻涂布于2%水瓊脂平板上[11],置于 25℃培養(yǎng)箱中,黑暗培養(yǎng)24 h后,檢測(cè)平板中孢子的菌落數(shù)。用下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)率:

1.2.8 產(chǎn)毒量測(cè)定

粗毒素制備參照鄭曉蓮等方法[12],并略做改進(jìn)。將供試菌接到PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)7 d后,從平板上取5塊直徑為4 mm的菌塊接種到250 mLPD培養(yǎng)基中,置于25℃搖床中振蕩培養(yǎng)30 d后,四層紗布過濾,在 3000 g?min-1下離心15 min,121℃下高溫滅菌30 min。即為粗毒素。將濾液用無菌水稀釋成1%、2%、5%、10%、20%、50%、100%7個(gè)濃度,將在各濃度藥液里浸泡24 h的番茄種子在光照培養(yǎng)箱中無菌保濕培養(yǎng),3 d后計(jì)算萌發(fā)率抑制中濃度以比較其產(chǎn)毒量。

1.2.9 突變體和敏感菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)能力測(cè)定

參照紀(jì)兆林[11]及Schepers[13]競(jìng)爭(zhēng)能力的測(cè)定方法進(jìn)行。競(jìng)爭(zhēng)能力試驗(yàn)用孢子懸浮液接種,將抗藥突變體和敏感菌株的孢子懸浮液配成相同濃度(1×105孢子?mL-1)后等量混合成不同組合;組合1:S42+R42-2;組合 2:S38+R38-5;組合 3:S42+R42-8;組合4:S42+R42-3。組合1-4均為抗性突變體與其親本敏感菌株的組合。用毛筆將孢子混合液涂抹于番茄葉片上,發(fā)病后挑選單個(gè)病斑,用打孔器將病斑取下,并分離病菌。再用含100 μ g?mL-1的嘧菌酯平板鑒定其抗藥性,計(jì)算抗感菌比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄早疫病菌的抗性誘導(dǎo)

敏感菌株S42經(jīng)紫外照射2 min和8 min后,獲得了突變體R42-2和 R42- 8;S38經(jīng)紫外照射5 min后獲得抗性突變體R38-5。藥劑馴化沒有出現(xiàn)扇形突變體菌落,藥劑誘導(dǎo)未成功。

2.2 抗性水平測(cè)定

S38、S42菌株在室內(nèi)經(jīng)紫外線誘導(dǎo),共獲得了3株高抗性突變體,采用孢子懸滴法測(cè)定了抗藥性突變體的EC50值。測(cè)試結(jié)果見表1,紫外線誘導(dǎo)獲得突變體的 EC50為 8.8443～ 21.7154 μ g ?mL-1,其親本菌株的 EC50為0.0237～0.0335 μ g?mL-1,兩者進(jìn)行對(duì)比,抗性指數(shù)在267.22～656.05倍之間,達(dá)到了高抗水平。

表1 番茄早疫病抗藥菌株對(duì)嘧菌酯的敏感性Table 1 The sensitivity of Alternaria solani mutants to azoxystrobin

2.3 突變體遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

由表2可看出,經(jīng)紫外光照射誘導(dǎo)產(chǎn)生的番茄早疫病菌抗嘧菌酯菌株R42-2和R42-8為高等抗性,抗性菌株連續(xù)在無藥PDA平板上轉(zhuǎn)接10代后,病菌仍能生長,菌絲茂密,說明其抗藥性穩(wěn)定,經(jīng)多代無性繁殖后其抗性不喪失。

表2 R42-2、R42-8菌株的抗性水平測(cè)定結(jié)果Table 2 R42-2、R42-8resistance level measurements

由表2還可看出,所測(cè)兩個(gè)抗性菌株的EC50值不同,R42-2的抗性水平較高。說明在誘導(dǎo)出番茄早疫病菌抗嘧菌酯菌株的過程中,由于紫外光照射時(shí)間不同,即可獲得不同抗性水平的抗性菌株。無藥繼代培養(yǎng)10代后,兩個(gè)抗性菌株的抗性水平明顯提高,抗性菌株的耐藥性不斷增強(qiáng),抗藥性較穩(wěn)定,不易喪失。

2.4 抗性菌株的致病性測(cè)定

由表3可看出,敏感菌株在無藥情況下發(fā)病嚴(yán)重,接種4 d后,番茄葉子幾乎全部發(fā)病,發(fā)病面積接近100%,致病力極強(qiáng);抗性突變體,在無藥條件下較敏感菌株發(fā)病輕,病斑面積較小。由此可看出抗性突變體在無藥情況下其致病力要比敏感菌株弱。用嘧菌酯4 μ g?mL-1浸后的番茄葉片上,敏感菌株被抑制不發(fā)病;而抗性突變體表現(xiàn)出較高的耐藥性和致病性,病斑面積較大。

表3 抗性菌株及敏感菌株在番茄葉片上病斑面積Table 3 Lesion area of resistant and sensitive isolates in the tomato leaf

2.5 生長速率及產(chǎn)孢量測(cè)定(表4)

表4 抗藥突變體與親本菌株菌落生長直徑(cm)和產(chǎn)孢量的比較Table 4 Comparison of the inter-colony diameter growth(cm)between resistant strains with sensitive isolates and conidiation compared volume

由表4可看出,生長初期親本敏感菌株生長速率最大,抗性菌株(R42-8)與親本菌株的生長速率相近,抗性菌株(R42-2)生長的最慢。隨著時(shí)間的延長,R42-2的生長速率明顯加快,R42-8生長速度下降。突變體菌株的產(chǎn)孢量與其親本敏感菌株(S42)相比差異極不明顯,表明番茄早疫病菌對(duì)嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性變異后,其繁殖生長能力沒有明顯變化。

2.6 孢子萌發(fā)率測(cè)定

由表5可以看出突變體的萌發(fā)率較親本菌株有下降趨勢(shì),但經(jīng)鄧肯新復(fù)極差法計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果在5%顯著水平及1%極顯著水平上三個(gè)菌株之間差異不顯著。

表5 抗藥突變體與親本菌間孢子萌發(fā)率比較Table 7 Comparison of the spore germination rate between resistant and sensitive isolates

2.7 番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體與親本菌株產(chǎn)毒量測(cè)定(表6)

表6 番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體與親本產(chǎn)毒量比較Table 6 Comparison of capacity of the toxin-producing between the Alternaria solani resistant and sensitive isolates to azoxystrobin

從表6可看出,親本菌株和兩種突變體菌株的 粗毒素對(duì)番茄種子萌發(fā)抑制中濃度分別為4.09%、6.75%和11.7%,突變體菌株的粗毒素對(duì)番茄種子萌發(fā)抑制明顯加大。說明抗性菌株產(chǎn)毒量明顯增加,這會(huì)導(dǎo)致抗性菌株致病力上升。

2.8 抗藥突變體競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定

用紫外誘導(dǎo)獲得的嘧菌酯高抗菌株及其原始敏感菌株之間的競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定結(jié)果見圖1,1～4組合接種的病斑中,敏感菌株的頻率均高于抗性突變體。其中,抗性頻率最高的組合3也只達(dá)到42.2%,而最低的組合4僅為23.1%。說明敏感菌株孢子的競(jìng)爭(zhēng)能力要強(qiáng)于抗性突變體。

圖1 番茄早疫病菌抗感菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)能力Fig.1 The spores competitiveness of Alternariasolani resistant and sensitive isolate

3 結(jié)果與討論

本研究采用紫外照射成功誘導(dǎo)出番茄早疫病菌抗嘧菌酯的突變菌株,說明在大田條件下番茄早疫病菌群體出現(xiàn)抗嘧菌酯突變體的可能性存在。但對(duì)親本敏感菌S38、S42進(jìn)行抗性誘導(dǎo)其成功率較小,且藥劑馴化未成功,這可能與藥劑劑量、次數(shù)等因素有關(guān)。

抗性突變體與親本相比較,生長速率、繁殖能力并無差異,說明在大田條件下能形成抗性突變體群體并能與親本菌株群體共存。經(jīng)測(cè)定番茄早疫病菌粗毒素能明顯抑制番茄種子的萌發(fā),突變體與敏感菌株的產(chǎn)毒量比較結(jié)果表明,突變體產(chǎn)毒量明顯增大,但突變體的致病性強(qiáng)弱有何改變有待進(jìn)一步研究。

抗嘧菌酯的番茄早疫突變體連續(xù)培養(yǎng)多代抗性未衰退,說明其抗性很穩(wěn)定,不易喪失。因此,在生產(chǎn)實(shí)踐中一旦發(fā)現(xiàn)抗嘧菌酯的菌群形成,就應(yīng)立即采取措施,如換用作用機(jī)理不同的新殺菌劑品種,防止抗性群體繼續(xù)擴(kuò)大。

盡管目前在大田中尚未檢測(cè)到抗嘧菌酯的番茄早疫病菌,但已有關(guān)于番茄早疫病抗性菌株的報(bào)道[14],因此即使是嘧菌酯這類敏感性較高的藥劑在生產(chǎn)實(shí)踐中也應(yīng)該慎重使用。本文僅對(duì)番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體和敏感菌進(jìn)行了一些初步的生物活性測(cè)定,在以后的研究工作中應(yīng)進(jìn)一步比較抗性突變體和敏感菌株在分子生物學(xué)上的差異,其毒素的致病機(jī)理也有待于進(jìn)一步的研究,從而對(duì)番茄早疫病菌對(duì)嘧菌酯的抗性治理提供解決方案。

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Resistant Inducing ofAlternaria solanito Azoxystrobin and Determination of Mutant Characteristics

ZHOUJie-min,REN Lu,LIU Hui-ping,HAN Ju-cai,WANG Mei-qin
(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

The study aimed to evaluate the resistance risk ofAlternaria solanito azoxystrobin.It adopted UV-induced and taming of azoxystrobin to induce resistant mutations ofAlternariasolaniin laboratory,and chosed three EC50levels over 200μ g?mL-1ones.Comparing the resistant with sensitive isolates showed that the resistance obtained by two ways was stable after 10 subcultures on fungicide-free PDA.Sensitive isolates had highly pathogenic to the leaves containing no fungicides,infecting higher than 95%and the resistant isolates infected 70%more or less.But the sensitive isolates was non-pathogenic to the leaves with fungicides,and resistant isolates reached 80%.The hyphae growth rate of resistant isolates was slow,but the sporulation and spore germination rate of resistant isolates were not significantly different from those of their sensitive ones.The extract toxin of mutant isolate inhibited the tomato seed germination markedly.The spore germination of sensitive isolates was higher than the resistance mutant.

Alternariasolani;Azoxystrobin;UV-induced;Biological characteristics

S481+.4

A

1671-8151(2010)01-0019-05

2009-09-11

2009-12-15

周杰敏(1985-),女(漢),山東蓬萊人,碩士研究生,主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)方面的研究。

韓巨才,博士生導(dǎo)師。T el:0354- 6288351;E-mail:Jchan@sxau.edu.cn

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2007031039);山西省留學(xué)歸國基金(2007061、2009043);山西省自然基金(2008011066)

(編輯:楊忠義)