夏鳳國(guó),范建華

(1.北華大學(xué)第一臨床醫(yī)院 普外科,吉林 吉林132011;2.北華大學(xué)第一臨床醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,吉林 吉林132011)

肝纖維化是慢性肝病最重要的病理特征,也是進(jìn)一步向肝硬變發(fā)展的中間環(huán)節(jié)。目前研究表明:肝纖維化早期是可逆的。但到后期出現(xiàn)肝硬變時(shí)則不可逆,對(duì)于肝硬變,目前尚無(wú)行之有效的治療措施。目前”肝穿刺”活檢是診斷肝纖維化的金指標(biāo),但因其操作有創(chuàng)性,不易反復(fù)使用,使其應(yīng)用受到限制。在”無(wú)創(chuàng)”診斷肝纖維化方面,人們已經(jīng)找到許多與肝纖維化相關(guān)的血清標(biāo)志物,目前臨床上已經(jīng)將血清TGF-β1的檢測(cè)作為診斷早期肝纖維化的指標(biāo),但研究表明肝組織中TGF-β1mRNA表達(dá)與肝纖維化程度的相關(guān)性比血清TGF-β1更密切。故本實(shí)驗(yàn)旨在研究ICG15 min潴留率與細(xì)胞因子-β1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性,從基因水平,證明ICG15 min潴留率可以作為診斷早期肝纖維化的一個(gè)敏感指標(biāo)。前期實(shí)驗(yàn)已證明該實(shí)驗(yàn)與肝纖維化病理分期具有很好的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)Wistar大鼠52只,雌雄各半,體重180-250 g之間,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,清潔級(jí)條件喂養(yǎng),自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2試劑吲哚氰綠(ICG),購(gòu)自沈陽(yáng)濟(jì)世制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20045514;四氯化碳,購(gòu)自吉林市化學(xué)制劑廠;精制玉米油,購(gòu)自營(yíng)口渤海油脂工業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及模型制備 將52只大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和模型組(42只),模型組分四籠喂養(yǎng)。模型組(肝纖維化組),以液體石蠟和精制玉米油2:3配制成40%油溶液,首次以5 ml/kg體重皮下注射,以后3 d一次,3 ml/kg皮下注射。正常組不行任何處置。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食。每天觀察大鼠的一般狀況、飲食變化、行為(自主活動(dòng)、精神狀態(tài))變化、毛發(fā)變化。在造模過(guò)程中,死亡6只。

1.3.2ICG15分鐘潴留率測(cè)定方法ICG濃度按藥物說(shuō)明書(shū)繪制ICG標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品血漿1 ml加生理鹽水2ml稀釋混勻,752型紫外分光光度計(jì)805 nm處測(cè)定吸光度。查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ICG濃度。ICGR15=ICG濃度/1.0×100%.

1.3.3半定量RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)。

TGF-β1上游引物為:5′-GTAGACGATGGGCAGTGGCT-3′;下游引物為:5′-CTGGAAAGGGCTCAACACC-3′;擴(kuò)增片斷長(zhǎng)312bp。內(nèi)參GAPDH上游引物為:5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′;下 游 引 物 為:5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′;擴(kuò)增片斷長(zhǎng)616 bp。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,多組變量采用單因素方差分析,多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn),采用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算兩組變量相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1動(dòng)物大體情況觀察

正常組大鼠在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間活潑程度、自衛(wèi)意識(shí)、飲食飲水、體毛皮表等無(wú)明顯變化,無(wú)死亡。造模組大鼠1-4周間無(wú)明顯變化,5周以后體毛明顯不順,飲食飲水稍減少,但體重?zé)o減輕。造模8周結(jié)束后,造模組大鼠死亡2只。以上各組動(dòng)物經(jīng)麻醉打開(kāi)腹腔后,造模8周的大鼠腹腔有腹水,量不等。

2.2肝纖維化形成過(guò)程中不同時(shí)間ICG15 min潴留率與TGF-β1基因表達(dá)變化(見(jiàn)表1)

表1 肝纖維化形成過(guò)程中不同時(shí)間CG15分鐘潴留率與TGF-β1基因表達(dá)變化(s)

表1 肝纖維化形成過(guò)程中不同時(shí)間CG15分鐘潴留率與TGF-β1基因表達(dá)變化(s)

*P＜0.05,**P＜0.01與正常組比較

周數(shù)組別樣本量(只)ICG15分鐘潴留率(%)TGF-β1 mRNA量正常組 10 3.51±1.46 0.24±0.02第2周 10 3.62±1.84 0.27±0.02*第4周 10 3.68±1.37 0.36±0.03**第6周 10 7.62±2.14 0.42±0.04**第8周 10 11.82±2.32 0.50±0.06**

2.3細(xì)胞因子-TGFβ1基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)附圖

圖1 實(shí)驗(yàn)性肝纖維化形成過(guò)程中 TGF-β1mRNA的表達(dá)(半定量 RT-PCR)

2.4ICG15分鐘潴留率與細(xì)胞因子-TGFβ1基因表達(dá)相關(guān)性分析

ICG15分鐘潴留率與細(xì)胞因子-TGFβ1基因表達(dá)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為:0.909 9(P值均＜0.05)。

3 討論

吲哚氰綠(ICG)是一種暗綠色的無(wú)毒色素,副作用極少,其靜脈注射后被肝細(xì)胞選擇性攝取,并以原形排入膽汁,其不參與肝腸循環(huán),亦不經(jīng)腎臟排泄。影響其代謝的主要原因是肝血流量,有功能的肝細(xì)胞總數(shù),膽汁的分泌和膽道通暢程度。除上述外,還與血漿蛋白含量、竇側(cè)細(xì)胞膜通透性、肝細(xì)胞內(nèi)載體蛋白、肝細(xì)胞向毛細(xì)膽管排泄及轉(zhuǎn)運(yùn)能力、毛細(xì)膽管以下膽道通暢情況有關(guān)。已被應(yīng)用于肝儲(chǔ)備功能的檢測(cè)。根據(jù)其代謝特點(diǎn)能夠反映肝纖維化程度成為可能。

細(xì)胞因子在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用極為復(fù)雜。具有多樣性、雙向性,是當(dāng)前肝纖維化研究的活躍領(lǐng)域。在眾多的促肝纖維化形成的細(xì)胞因子中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,能夠調(diào)節(jié)幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡。它還是重要的免疫調(diào)節(jié)因子,也是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致纖維化因子。

1978年De Larco等學(xué)者在小鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株條件培養(yǎng)基中鑒定出具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化特性的物質(zhì),稱(chēng)之為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)這種 TGF包括兩種成分:TGFα、TGFβ;TGFα具有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用,TGFβ與器官纖維化有關(guān)。目前研究的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β,除非特指,一般均指TGF-β1。

3.1轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的分子結(jié)構(gòu)、受體及作用途徑

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β)屬生長(zhǎng)因子超家族,哺乳動(dòng)物組織中存在3種TGF-β亞型(TGF-β1-3)。TGF-β分子由390個(gè)氨基酸殘基的前體分子(pre-pro-TGF-β)C端裂解而來(lái)。此前體為25kDTGF-β,75kD的潛伏狀態(tài)相關(guān)肽(LAP)通過(guò)二硫鍵連接到潛在TGF-β結(jié)合蛋白(LTBP)上[1]。pre-pro-TGF-βN 端的信號(hào)肽在分泌前被裂解掉。體內(nèi)多種因素可導(dǎo)致裂解而活化 TGF-β[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是TGF-β家族中重要的一員,是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同或相近的分子量為12.5KD亞單位借二硫鍵連接而成的雙體結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮依賴(lài)于細(xì)胞表面的受體。幾乎所有的細(xì)胞表面都有TGF-β 受體(TβR),TβR 主要有三型:TβRⅠ 、TβRⅡ和TβRⅢ。TGF-β1對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積作用主要由Ⅰ型受體介導(dǎo);TGF-β1通過(guò)與細(xì)胞表面I型、Ⅱ型受體的結(jié)合,形成Ⅱ型受體-TGF-β1-I型受體三聚體復(fù)合物,磷酸化后的I型受體將信號(hào)放大傳遞給細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子Smad,從而產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[3]。

3.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1合成部位及來(lái)源

正常肝臟TGF-β1轉(zhuǎn)錄見(jiàn)于門(mén)靜脈周?chē)?xì)胞、導(dǎo)管周?chē)?xì)胞、肝小葉中央靜脈周?chē)?xì)胞及肝包膜間質(zhì)細(xì)胞。肝纖維化時(shí)上述部位的TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄增加。Sylke等[4]分離出HSC和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(PC),發(fā)現(xiàn)顯示TGF-β1和 LAP彌散分布在PC的胞漿,LTBP的免疫染色主要顯示在漿膜。而TGF-β1、LAP和LTBP在核周更明顯,提示其合成和分泌通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體完成的。正常情況下,其表達(dá)量較少。

國(guó)內(nèi)外的研究證實(shí),TGF-β1與纖維化關(guān)系極為密切,但對(duì)肝纖維化的不同階段其來(lái)源看法不同,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:在肝纖維化早期TGF-β1表達(dá)增加主要來(lái)源于肝間質(zhì)細(xì)胞,如肝星狀細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)TGF-β1,但隨著肝纖維化的發(fā)展,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如星狀細(xì)胞(HSC)、Kupffer細(xì)胞、竇周細(xì)胞是肝內(nèi)TGF-β1的主要產(chǎn)生細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法測(cè)定TGF-β1mRNA量,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,在正常對(duì)照組,TGF-β1 mRNA量為(0.24±0.02)較少,表明維持肝臟的正常組織結(jié)構(gòu)需要TGF-β1的參與,才能保持一種動(dòng)態(tài)平衡,這種平衡一旦被打破(如各種損傷因子對(duì)肝臟的損傷),TGF-β1mRNA表達(dá)量將逐漸增加,并進(jìn)入惡性循環(huán)。模型第2周TGF-β1mRNA表達(dá)量為(0.27±0.02)至模型第8周組TGF-β1mRNA量為(0.50±0.06),TGF-β1mRNA量逐漸增加,且各組間差異具有顯著性(P＜0.01);提示CCl4可在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)TGF-β1的生成,且隨著CCl4注射次數(shù)的增多致肝臟損害程度的加重,TGF-β1mRNA量增加更明顯。提示TGF-β1mRNA表達(dá)量與肝臟病變發(fā)展階段的一致性。與目前公認(rèn)的結(jié)果相同。在此動(dòng)態(tài)觀察TGF-β1mRNA表達(dá)過(guò)程中,同時(shí)測(cè)定的ICG15分鐘潴留率也隨著肝臟損害程度的加重而增加,并與TGF-β1mRNA表達(dá)量作相關(guān)分析,結(jié)果兩者呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為г=0.9099,p值＜0.05),提示ICG15分鐘潴留率與肝臟纖維化形成過(guò)程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-TGF-β1mRNA表達(dá)變化的一致性,能夠反映肝纖維化早期肝臟的微觀變化。從參與肝纖維化的細(xì)胞因子-TGF-β1mRNA表達(dá)的角度驗(yàn)證ICG15分鐘潴留率能夠診斷早期肝纖維化。

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