侯盼飛, 應(yīng)春妹, 汪雅萍, 葉楊芹, 張灝旻

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌,主要引起醫(yī)院獲得性肺炎尤其是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、菌血癥、尿路感染和繼發(fā)性腦膜炎等。近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性呈上升趨勢(shì),尤其是出現(xiàn)了碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥菌株,給臨床治療帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要原因,本課題對(duì)80株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥耐藥性及產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶進(jìn)行研究。

材料與方法

一、材料

(一)臨床菌株 收集2009年1月—10月我院分離鮑曼不動(dòng)桿菌共80株,其中亞胺培南耐藥50株,敏感30株,標(biāo)本種類(lèi)包括痰液、引流液、尿液、血液、腦脊液、膿液、咽拭子、膽汁和插管等。所有菌株經(jīng)VITEK-32細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)鑒定。

(二)質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922。

(三)抗菌藥物 阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢哌酮、他唑巴坦、舒巴坦、磺胺甲唑-甲氧芐啶、美羅培南和多黏菌素B等抗菌藥物制劑購(gòu)自上?？萍阉帣z器材公司。頭孢吡肟由中美上海施貴寶制藥有限公司惠贈(zèng),亞胺培南由默沙東制藥有限公司惠贈(zèng),哌拉西林由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所惠贈(zèng)。

(四)試劑 T aq DNA 聚合酶、10×PCR buffer(含MgCl2)、dNTPs mixture為上海閃晶生物科技有限公司產(chǎn)品。

(五)儀器 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品,凝膠成像儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

二、方法

(一)藥敏試驗(yàn) 用瓊脂稀釋法檢測(cè)80株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的MIC。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2009年版。①抗菌藥物配制：抗菌藥物原液均配制成4 000 mg/L,試驗(yàn)中采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度,最終試驗(yàn)濃度從256～0.0625 mg/L。頭孢哌酮-舒巴坦中頭孢哌酮、舒巴坦的配制比例為2∶1,磺胺甲唑與甲氧芐啶比例為9∶1,哌拉西林-他唑巴坦中哌拉西林濃度從256～0.0625 mg/L,他唑巴坦為4 mg/L。②菌液制備：取培養(yǎng)過(guò)夜的純菌落,用生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫?再稀釋10倍,取1 μ L用于接種。35 ℃孵育20～24 h,觀(guān)察結(jié)果。③用WHONT 5軟件分析結(jié)果,SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(二)AmpC酶表型檢測(cè) 參照 Coudron等[1]報(bào)道的三維試驗(yàn)方法。①酶粗提物制備：挑取血平皿上已純培養(yǎng)18～24 h的菌落3～5個(gè),接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中,35℃培養(yǎng)6 h左右,定時(shí)混勻,4 000 r/min離心30 min,棄上清液,沉淀物于-80℃和35℃反復(fù)凍融8次(每次要凍2 h以上再取出融化),加入0.01 mol/L PBS(pH7.0),4℃10 000 r/min離心20 min,上清液即為酶提取物。②三維試驗(yàn)：將0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊拇竽c埃希菌(ATCC 25922)菌液涂布于MH平皿上,取一頭孢西丁藥敏紙片貼在平皿中心,用無(wú)菌刀片在離紙片邊緣5 mm處切一小槽,在小槽內(nèi)加入50 μ L酶提取物,35℃培養(yǎng)過(guò)夜觀(guān)察結(jié)果。當(dāng)抑菌圈不完整,小槽近頭孢西丁紙片端與抑菌圈交接處出現(xiàn)向平皿中心擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)為AmpC酶陽(yáng)性,抑菌圈完整者為陰性。

(三)EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn) 按照紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程,將細(xì)菌配成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?均勻涂布在MH瓊脂平皿上,分別貼2張亞胺培南藥敏紙片,2紙片中心相距＞25 mm。在其中1張紙片上滴加500 mmol/L(pH=8.0)EDTA溶液5 μ L。35 ℃培養(yǎng) 20 h觀(guān)察結(jié)果。亞胺培南+EDTA紙片與單純亞胺培南紙片的抑菌圈直徑之差≥7 mm為金屬酶陽(yáng)性[2]。

(四)模板制備 從血平皿上挑取3～4個(gè)受試菌菌落于生理鹽水300 μ L中,制成細(xì)菌懸液,混勻。10 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入無(wú)菌雙蒸水300 μ L,混勻。細(xì)菌懸液100℃水浴,15 min后離心,12 000 r/min離心2 min,取上清液即為DNA模板。

(五)PCR擴(kuò)增 總反應(yīng)體系為 50 μ L,其中10×緩沖液(含 MgCl2)14 μ L,dNTPs(各 2.5 mmol/L)mixture 1 μ L,DNA 模 板 2.5 μ L,上下游 引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ L,Taq 酶 0.5 μ L,dH2O 31 μ L。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性30 s,54℃復(fù)性45 s(OXA-51為52℃復(fù)性50 s),72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠(含EB)電泳觀(guān)察特異性擴(kuò)增條帶,引物序列見(jiàn)表1。

(六)測(cè)序 由上海閃晶分子生物科技有限公司協(xié)助完成,結(jié)果用基因庫(kù)中的Blast程序進(jìn)行同源分析。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

50株IRAB中MIC50＞128 mg/L的抗菌藥物有阿米卡星、環(huán)丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢西丁、磺胺甲唑-甲氧芐啶,MIC50在32～128 mg/L的抗生素有美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶,MIC50＜8 mg/L的抗菌藥物有左氧氟沙星和多黏菌素B。30株ISAB對(duì)頭孢西丁耐藥率最高,MIC50為256 mg/L,MIC50＜8 mg/L的藥物有美羅培南、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和多黏菌素B。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,IRAB與ISAB除對(duì)頭孢吡肟、頭孢西丁、多黏菌素B耐藥性較一致外,對(duì)其他抗菌藥耐藥性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見(jiàn)表2。

表1 PCR擴(kuò)增基因型及引物序列Table 1.The sequences of primers used for PCR

表2 IRAB和 ISAB耐藥性比較(MIC：mg/L)Table 2.Resistance comparison between IRAB and ISAB strains(M IC：mg/L)

二、三維試驗(yàn)結(jié)果

50株IRAB中有42株AmpC表型陽(yáng)性(84%),30株ISAB中有9株陽(yáng)性(30%)。

三、EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果

80株鮑曼不動(dòng)桿菌中均未檢測(cè)到金屬酶。

四、基因檢測(cè)結(jié)果

在50株IRAB中OXA-23、AmpC陽(yáng)性的分別為36株(72%)和45株(90%)。其中OXA-23和AmpC同時(shí)陽(yáng)性的 35株(70%);30株 ISAB中OXA-23、AmpC陽(yáng)性的分別為4株(13.3%)和20株(66.7%),其中同時(shí)陽(yáng)性的4株(13.3%),見(jiàn)圖1。IRAB與ISAB相比,OXA-23陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而AmpC陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),80株細(xì)菌中OXA-51均為陽(yáng)性,未檢測(cè)到 OXA-24、OXA-58、IMP-1 、IMP-4、VIM-2基因,見(jiàn)表3。

五、測(cè)序結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果經(jīng)blast比對(duì),OXA-23、OXA-51和AmpC 與Genbank相關(guān)基因同源性分別為100%、99%和99%。

圖1 部分IRAB菌株 AmpC、OXA-51和OXA-23β內(nèi)酰胺酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖FIG.1.Electrophoresis of PCR products for β-lactamase genes AmpC,OXA-51 and OXA-23 in some imipenem-resistant Acinetobacterbaumannii strains

表3 AmpC和OXA型酶基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中的檢測(cè)結(jié)果Table 3.Distribution of AmpC and OXA genes in Acinetobacter baumannii

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛分布于周?chē)h(huán)境和正常人皮膚、呼吸道等部位,是一種重要的條件致病菌,近年來(lái)耐藥率逐年升高。尤其是耐亞胺培南菌株的出現(xiàn),給臨床治療帶來(lái)很大挑戰(zhàn),使許多患者面臨“無(wú)藥可治”的困境。本研究對(duì)我院臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),亞胺培南耐藥菌株同時(shí)對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、磺胺類(lèi)等抗菌藥耐藥,但仍對(duì)多黏菌素B敏感,含酶抑制劑頭孢哌酮-舒巴坦的抑菌效果優(yōu)于單藥頭孢哌酮。這與2008年CHINET監(jiān)測(cè)的結(jié)果基本一致[3]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,IRAB與ISAB相比,對(duì)頭孢吡肟、頭孢西丁、多黏菌素B耐藥性較一致,對(duì)其他抗菌藥耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要原因之一。按照Ambler分類(lèi)方法,β內(nèi)酰胺酶分ABCD 4類(lèi)。A類(lèi)酶,主要是超廣譜酶(ESBLs),如SHV、TEM、PER、CTX等。B 類(lèi)酶,活性位點(diǎn)為2價(jià)金屬陽(yáng)離子,故又被稱(chēng)為金屬β內(nèi)酰胺酶(MBLs),對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素具有廣泛的水解作用,目前在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的B類(lèi)酶包括 IMP-1 、IMP-4 、IMP-6、VIM-2、VIM-3、SIM-1等[4],但國(guó)內(nèi)對(duì)此類(lèi)酶報(bào)道較少。C類(lèi)酶,即AmpC酶,主要分解第三代頭孢菌素及單環(huán)酰胺類(lèi),可被氯唑西林、Syn 2190抑制。本研究中,PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)45株IRAB、20株ISAB AmpC基因陽(yáng)性,陽(yáng)性率分別為90%和66.7%,χ2檢驗(yàn)表明,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè)我院AmpC基因的高檢出率可能主要與頭孢菌素類(lèi)耐藥有關(guān)而與亞胺培南耐藥關(guān)系不大。與三維試驗(yàn)結(jié)果比較,我們發(fā)現(xiàn)共有14株P(guān)CR結(jié)果陽(yáng)性而表型陰性的菌株,可能原因是表型檢測(cè)靈敏度較低引起的假陰性。D類(lèi)酶,又被稱(chēng)為苯唑西林酶[5],是鮑曼不動(dòng)桿菌耐菌藥機(jī)制中研究最多的。根據(jù)基因同源性不同,又可分為 4組 ：OXA-23、OXA-24、OXA-51 和 OXA-58。OXA-51廣泛存在于鮑曼不動(dòng)桿菌中,常被認(rèn)為是該菌的標(biāo)志性基因,可引起對(duì)苯唑西林、氯唑西林和亞胺培南的天然低水平耐藥。本研究的80株鮑曼不動(dòng)桿菌中,OXA-51也均為陽(yáng)性。OXA-23,是目前報(bào)道最多的β內(nèi)酰胺酶,可引起對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)等多種抗生素耐藥,可被舒巴坦、克拉維酸等抑制。本研究檢測(cè)到36株IRAB(72%)、4株 ISAB(13.3%)OXA-23基因陽(yáng)性,與我們前期研究及其他學(xué)者報(bào)道基本一致[6-7]。具有OXA-23基因通常對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥,但我們研究發(fā)現(xiàn)4株OXA-23基因陽(yáng)性而對(duì)亞胺培南敏感的菌株,這4株細(xì)菌對(duì)頭孢哌酮、哌拉西林-他唑巴坦、磺胺甲唑-甲氧芐啶均耐藥,對(duì)美羅培南中介或耐藥。李蓉等[8]也發(fā)現(xiàn)OXA-23陽(yáng)性而對(duì)亞胺培南敏感的菌株,其原因我們還將做進(jìn)一步研究。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,IRAB與ISAB的OXA-23陽(yáng)性率有顯著差異,推測(cè)它可能是造成鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥的重要原因之一。

本組IRAB中OXA-23基因廣泛存在,是導(dǎo)致本院分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥的重要原因,是否有其他機(jī)制參與耐藥尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)提示我們應(yīng)加強(qiáng)耐藥表型與耐藥機(jī)制的研究,嚴(yán)格監(jiān)測(cè)、合理使用抗菌藥,以防止耐藥菌株播散。

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