于明薇，孫桂芝，祁 鑫，李道睿，張培彤，吳 潔

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。長期以來，國內(nèi)外研究均表明在T細(xì)胞中存在抑制亞群，能顯著下調(diào)免疫應(yīng)答，并在腫瘤位點(diǎn)產(chǎn)生免疫耐受。Sakaguchi等在1995年發(fā)現(xiàn)鼠源性的CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞亞群，無論在體內(nèi)還是體外均表現(xiàn)出獨(dú)特的抑制功能，Lewis肺癌移植鼠脾臟CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量與正常小鼠相比明顯升高，有利于腫瘤耐受的形成，降低免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文將探討活血及益氣活血兩種不同治法中藥代表蘇木、蘇木+黃芪對(duì)Lewis肺癌移植小鼠脾CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)及相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物

黃芪、蘇木浸膏由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑中心提供，生產(chǎn)批號(hào)20071121。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，體重20g±2g，清潔級(jí)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證號(hào)SCXK-11-00-0006)，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物室喂養(yǎng)(許可證號(hào)SYXK(京)2005-0001)。Lewis肺癌荷瘤鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。

1.3 試劑

FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD25、CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit、LD、MS Columns(Miltenyi Biotic)，RevertiAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，SYBR Green I Master Mix(Applied Biosystems)，引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成。

1.4 儀器

FACS Calibur Flow Cytometer System(BD)，SM800解剖顯微鏡(Nikon)，VarioMACS磁性細(xì)胞分選儀(Miltenyi)，ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI)，DU-640型紫外分光光度計(jì)(Beckman)等。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型復(fù)制 取傳代后12d Lewis肺癌荷瘤小鼠，剝離瘤組織，選取生長良好的腫瘤組織，制備Lewis肺癌細(xì)胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2ml(約含活細(xì)胞1×106)。

1.5.2 分組及給藥 小鼠接種后隨機(jī)分為3組，接種后24h始至處死止，每日灌胃給藥1次。荷瘤對(duì)照組給予生理鹽水灌胃0.2ml/d，蘇木組、蘇木+黃芪組分別給予蘇木(1.67g生藥/(kg·d))、蘇木+黃芪(蘇木1.67g生藥/(kg·d)+黃芪15g生藥/(kg·d))中藥浸膏灌胃。

1.5.3 觀察指標(biāo) 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)小鼠體重的影響動(dòng)態(tài)觀察:于接種后6、10、15、20d處死每組荷瘤小鼠各6只，稱荷瘤小鼠體重，剝離腫瘤組織，電子天平稱取瘤重。小鼠體重=荷瘤小鼠體重－瘤重。

蘇木、蘇木+黃芪對(duì)小鼠瘤重和抑瘤率的影響動(dòng)態(tài)觀察:于接種后6、10、15、20d處死每組小鼠各6只，剝離腫瘤組織，電子天平稱取瘤重。按下列公式計(jì)算抑瘤率:抑瘤率(%)=[1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重(g)/對(duì)照組平均瘤重(g)]×100%。

蘇木、蘇木+黃芪對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移抑制率的影響:于接種后20d處死每組小鼠各6只，取肺用生理鹽水沖洗，Bouin液固定，解剖顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)。肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)=[1－實(shí)驗(yàn)組平均肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)(個(gè))/對(duì)照組平均肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)(個(gè))]×100%。

蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠脾CD4+CD25+細(xì)胞表達(dá)的影響觀察:于接種后15d取每組小鼠各6只，摘眼球放血，斷頸處死小鼠，酒精消毒皮膚，迅速取脾稱重、研磨，200目濾網(wǎng)濾過包膜及脂肪組織等，加入2mL PBS，收集脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取約1×106細(xì)胞重懸于100μL PBS中，按照試劑說明書進(jìn)行FITC-CD4、APC-CD25染色，上機(jī)檢測。

小鼠脾CD4+CD25+細(xì)胞磁珠分離及純度檢測:接種后15d取每組小鼠各3只，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，溶血后按照CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit試劑說明書要求進(jìn)行細(xì)胞磁性標(biāo)記并分離，取1×106分選后細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分選純度。

蘇木、蘇木+黃芪作用后荷瘤小鼠瘤組織及脾分選后 CD4+CD25+細(xì)胞 Foxp3、CTLA-4 mRNA表達(dá)檢測:實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測 Foxp3、CTLA-4 mRNA表達(dá)，取5×105分選后CD4+CD25+細(xì)胞和100mg瘤組織，分別提取 RNA。引物:Foxp3-S 5’-TGTGAGGACTAC-CGAGCC-3′， Foxp3-A 5′-AGGAGAAAGCGGATACCA-3′; CTLA4-S 5′-ACCTTCAGTGGT-GTTGGCTAG-3′， CTLA4-A 5′-TAAATCTGCGTCCCGTTGC-3′。PCR 反 應(yīng) 條 件:95.0(C 5min，95.0(C 25sec，55.0(C 25sec，72.0(C 50sec，72.0(C 5min，循環(huán)次數(shù)為 40。設(shè) β-actin 作為內(nèi)參照。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)小鼠體重的影響動(dòng)態(tài)觀察

各組小鼠體重隨荷瘤天數(shù)的增加呈下降趨勢，各時(shí)間點(diǎn)各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)小鼠瘤重和抑瘤率的影響動(dòng)態(tài)觀察

表1顯示，6d瘤重蘇木組(0.10g±0.06g)與荷瘤對(duì)照組(0.24g±0.11g)相比存在差異(P<0.05)，10d瘤重蘇木+黃芪組(0.82g±0.13g)與荷瘤對(duì)照組(1.82g±0.28g)相比存在差異(P<0.05)，各組抑瘤率隨荷瘤天數(shù)的增加總體呈降低趨勢。

表1 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

表1 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

時(shí)間(d)蘇木組(%)蘇木+黃芪組(%)58.33 50.00 10 43.96 54.95 15 34.16 37.08 6 20 16.11 26.09

2.3 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移抑制率的影響

表2顯示，各中藥組小鼠20d肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)均低于對(duì)照組，其中蘇木+黃芪組肺轉(zhuǎn)移抑制率為77.75%。

表2 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

表2 蘇木、蘇木+黃芪抑瘤率觀察(s，n=6)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P<0.05

荷瘤對(duì)照組 蘇木組 蘇木+黃芪組肺 轉(zhuǎn) 移 灶 個(gè) 數(shù) 12±7 9±3.6 2.67±1.53*肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)—25.00 77.75

2.4 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠脾CD4+CD25+表達(dá)的影響

15d各組小鼠脾CD4+細(xì)胞表達(dá)無差異，蘇木+黃芪組小鼠脾 CD4+CD25+細(xì)胞表達(dá)(10.02±0.71)%低于荷瘤對(duì)照組(11.74±1.76)%(P<0.05)。

2.5 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+細(xì)胞磁珠分離和純度檢測

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測鑒定，分選后小鼠脾CD4+CD25+細(xì)胞純度為85.38% ～88.19%。

2.6 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠瘤組織及脾分選后 CD4+CD25+細(xì)胞 Foxp3，CTLA-4 mRNA表達(dá)的影響

表3 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠瘤組織及脾CD4+CD25+分選后細(xì)胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表達(dá)的影響(s)

表3 蘇木、蘇木+黃芪對(duì)荷瘤小鼠瘤組織及脾CD4+CD25+分選后細(xì)胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表達(dá)的影響(s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P<0.05

瘤組織(n=6)分選后CD4+CD25+細(xì)胞(n=3)組 別Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin)Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin )荷瘤對(duì)照組1.45±0.13 1.60±0.08 1.89±0.16 1.12±0.03 1.27±0.09蘇 木 組 1.69±0.09 2.03±0.18 1.21±0.06 1.32±0.17蘇木+黃芪組 1.73±0.08*2.08±0.09*1.24±0.07*

表3顯示，蘇木 +黃芪組荷瘤小鼠瘤組織CTLA-4 mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)低于荷瘤對(duì)照組(P<0.05);蘇木+黃芪組荷瘤小鼠脾CD4+CD25+分選后細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)低于荷瘤對(duì)照組(P<0.05)，而CTLA-4 mRNA表達(dá)3組間無差異。

3 討論

CD4+CD25+Treg最早在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，這類細(xì)胞來源于胸腺，在小鼠的外周血、脾臟和淋巴結(jié)中均可發(fā)現(xiàn)，且具有相似的功能。在小鼠的脾臟和淋巴組織的CD4+T細(xì)胞中，CD4+CD25+細(xì)胞約占5% ～10%。CD4+CD25+Treg發(fā)揮免疫抑制功能的詳細(xì)機(jī)制尚未完全明了，目前認(rèn)為主要通過作用下列靶細(xì)胞發(fā)揮作用:抑制效應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞的活化增殖和免疫輔佐功能;抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，抑制 IFN-γ、IL-2產(chǎn)生和CD25表達(dá)來抑制CD8+T細(xì)胞的活化，或直接殺傷CD8+效應(yīng)T細(xì)胞;抑制樹突狀細(xì)胞成熟或下調(diào)DC的CD80和CD86共刺激分子表達(dá);抑制T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白等。

研究發(fā)現(xiàn)，Treg的抑制作用既發(fā)生在淋巴組織，抑制效應(yīng)細(xì)胞活化的最初啟動(dòng)階段，又發(fā)生在腫瘤微環(huán)境等外周性部位，抑制效應(yīng)性細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞等作用的最終效應(yīng)階段，Treg對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的整個(gè)過程都起一定的作用。腫瘤微環(huán)境最早于1979年由Lord正式提出，是腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等共同組成。局部微環(huán)境的腫瘤抗原可顯著誘導(dǎo)特異Treg細(xì)胞生成，稱為腫瘤特異Treg細(xì)胞。

Foxp3是Fox家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，有著調(diào)控CD4+CD25+Treg的發(fā)育及功能的作用。Foxp3基因高表達(dá)于淋巴組織，尤其特異性地表達(dá)于CD4+T細(xì)胞群，在其他細(xì)胞亞型和組織中也有極少量的表達(dá)，如B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、腦組織、心臟、腎和肺。隨著對(duì)Foxp3研究的深入，發(fā)現(xiàn)無論是胸腺還是外周起源的CD4+CD25+Treg細(xì)胞都能特異性地表達(dá)Foxp3，由此推測Foxp3可能是CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性的標(biāo)志。

CTLA-4是B7/CD28家族成員，Treg結(jié)構(gòu)性表達(dá)CTLA-4，CD4+CD25+Treg細(xì)胞活化后，CTLA-4的表達(dá)增加，并持續(xù)表達(dá)。CTLA-4與效應(yīng)細(xì)胞上的CD80/CD86結(jié)合，將抑制信號(hào)逆向傳遞給效應(yīng)細(xì)胞，從而抑制效應(yīng)細(xì)胞功能。此外，CD4+CD25+Treg表面的CTLA-4與DC細(xì)胞表面的CD80/CD86結(jié)合，通過逆向轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)導(dǎo)致DC細(xì)胞內(nèi)的吲哚氨2，3-雙加氧酶(IDO)活化，IDO是色氨酸代謝所必需的酶，由于IDO的活化使得游離的色氨酸減少，從而導(dǎo)致了T的活化程度降低。

蘇木味甘、咸、性平，具有活血散結(jié)、舒筋通絡(luò)、鎮(zhèn)靜、祛痰、止痛等功效。20世紀(jì)70年代，日本學(xué)者開始蘇木藥理作用的研究，通過幾十年來國內(nèi)外不斷探索與研究，發(fā)現(xiàn)蘇木具有抗腫瘤活性。黃芪味甘、性溫，歸脾、肺經(jīng)，可補(bǔ)氣升陽、固表止汗、托瘡生肌、利水退腫，為補(bǔ)氣之要藥。近年來研究認(rèn)為，黃芪與活血藥配伍后具有增強(qiáng)活血藥抗血小板聚集作用，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全血比黏度，降低白細(xì)胞黏附性和白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)率等作用。本研究結(jié)果顯示，益氣活血組方蘇木+黃芪較其單純活血藥成分蘇木有較好的抑瘤、抗轉(zhuǎn)移、下調(diào)CD4+CD25+細(xì)胞及相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的作用，提示蘇木+黃芪可通過影響荷瘤小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)改善體內(nèi)存在的免疫耐受狀態(tài)，而其在淋巴組織和腫瘤微環(huán)境中都表現(xiàn)出作用，也為中藥的全身調(diào)節(jié)特點(diǎn)提供了佐證。