王 迅，洪亞輝

（湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科類蔬菜，含有豐富的維生素C，是日常食物的調料品[1]。近些年辣椒病害發(fā)生嚴重，對農民造成越來越大的經濟損失。通過改造基因來培育辣椒抗病品種越來越受到重視[2]。同時，組織、細胞及原生質體培養(yǎng)方面的研究迅速發(fā)展，誘變與組織培養(yǎng)相結合，對增加遺傳變異率、減少育種時間和改進育種技術將具有很大潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為株洲醴陵的玻璃牛角椒。

1.2 方法

1.2.1 辣椒植株再生體系建立 （1）無菌苗的培養(yǎng)。將精選種子用清水浸泡 8～12 h，1%升汞消毒10 min，無菌水清洗 3～5次，播種于MS培養(yǎng)基中，置于暗處萌發(fā)。待胚根露出后轉入人工氣候箱中培育壯苗。培養(yǎng)條件：白天 26℃，夜晚 20℃，光照14 h/d，光強 2 000～2 500 Lx。

（2）愈傷組織的誘導。待無菌苗長到3～4 cm，取無菌苗在超凈工作臺上將其子葉切下，再切成2～3段，并在非截面邊切下1 mm左右的邊（目的是產生更多的創(chuàng)傷面）。將切好的子葉轉入不同激素配比的愈傷誘導培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設光照16 h，晝溫度27℃，夜溫度24℃。培養(yǎng)基主要成分是MS的基礎培養(yǎng)基，為了篩選出最適的愈傷組織誘導培養(yǎng)基，在參考了其它文獻后決定共用3種激素：6-BA，KT，IAA，設立 12 種配比，分別用辣椒的莖和子葉來作為外植體誘導愈傷組織生長。經過20 d的培養(yǎng)后觀察，統(tǒng)計愈傷組織的生長狀況。

（3）不定芽與不定根的誘導。待幼芽長至2～3 cm后，取其子葉根據(jù)長度切成2～3段，近軸面朝上接種于誘芽培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計不定芽誘導情況。待不定芽長出 0.5～1 cm的葉子后將幼芽自基部切下，插入生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。通過添加不同濃度的IAA、IBA和NAA組合來篩選最佳培養(yǎng)基，20 d后統(tǒng)計不定芽的生根情況，確定最適的生根培養(yǎng)基。待苗長出較發(fā)達的不定根系并有 3～5 cm高后，打開瓶蓋煉苗48 h。然后洗凈苗根部的殘余培養(yǎng)基，移植到滅菌土中。

1.2.2 輻射誘變處理 輻射設3個梯度，劑量分別為 20、40、60 Gy。以未經輻射處理的材料為空白對照。60Co-γ射線處理由湖南省原子能農業(yè)應用所完成。

（1）輻射后再生植株染色體觀察。待移栽的再生苗生長到8～10 cm高后對其進行形態(tài)學及細胞學觀察。取誘變后植株的根尖，每個劑量處理取5個以上植株，每個植株取3個以上的根尖，將根尖剪下于卡諾氏液（冰乙酸1份，無水乙醇3份）中固定2～4 h。如需長時間保存，則將固定好的根尖保持在體積分數(shù)為70%的酒精中置于冰箱內4℃存放。固定后的根尖經體積分數(shù)為70%的酒精處理后，轉入蒸餾水中漂洗5～6遍，洗去根尖表皮細胞上附著的酒精，使著色更加充分，在預熱60℃的1mol/L HCl中處理2～3min，沖洗5～6遍，卡寶品紅染色 5 min，壓片鏡檢，在光學顯微鏡（600×）下進行染色體數(shù)目的觀察并計數(shù)。

（2）誘變后的再生培養(yǎng)。經輻射誘變的辣椒愈傷組織立即轉入高營養(yǎng)MS培養(yǎng)基恢復生長，5 d后轉入生芽培養(yǎng)基。待再生芽點長出0.5 cm2的葉子后，轉入生根培養(yǎng)基。待苗長出較發(fā)達的不定根系并有 3～5 cm高后，打開瓶蓋煉苗48 h。然后洗凈苗根部的殘余培養(yǎng)基，移植到滅菌土中。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對辣椒愈傷組織誘導的影響

經過20 d的培養(yǎng)后觀察，統(tǒng)計了愈傷組織的生長狀況，發(fā)現(xiàn)子葉和莖都能很好的誘導出愈傷組織，但6-BA的效果比KT普遍要好。其中子葉以3～5 mg/L的6-BA加0.5 mg/L的IAA誘導率最高，而莖在7 mg/L的6-BA加0.5 mg/L的IAA誘導率最高。

2.2 不同激素配比對辣椒外植體再生分化的影響

從試驗結果可以看出，用苗齡10 d左右辣椒子葉作為外植體來誘導再生植株，其芽分化和根分化能力均比較高，莖誘導分化不定根的能力比子葉要強，但誘導分化不定芽的能力很低。用MS培養(yǎng)基添加3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3誘導不定芽再生的效果最好，其中加入的硝酸銀能夠顯著提高芽分化率，與未加硝酸銀的相比，分化率可提高30%以上，并大大縮短分化時間（表1）。但過高濃度的硝酸銀會造成植株莖葉畸形[3-5]，經篩選，以3～4 mg/L的硝酸銀濃度最為合適。

表1 不同激素組合對不定芽誘導的影響

用愈傷組織誘導再生根是以MS基礎培養(yǎng)基添加0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA誘導不定根的分化效果最好，分化率達73.5%左右；在根的分化方面，由莖誘導的愈傷組織比子葉誘導的愈傷組織具有更強的分化能力（表2）。

表2 不同激素組合誘導再生根的影響

2.3 不同輻射劑量下再生植株的染色體變異分析

通過顯微壓片技術對輻照后的辣椒再生植株進行染色體觀察并計數(shù)，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目出現(xiàn)了不同程度的變異。隨著輻射劑量的增加，細胞染色體損傷也隨之加重，通過對再生苗的不定根做根尖染色體染色壓片，在顯微鏡下可觀察到有絲分裂時出現(xiàn)的連橋（圖1）。

2.4 不同輻射劑量對外植體再生分化的影響

在辣椒愈傷組織經不同劑量的60Co-γ照射處理后，不同程度的表現(xiàn)出生長受到抑制，分化減緩，分化率降低，甚至褐化死亡的現(xiàn)象。輻射劑量越高，成活率越低，恢復生長分化所需時間越長，分化率越低。在20 Gy劑量下分化能力明顯降低，但在兩周后大部分開始恢復生長，30 d后有小部分出現(xiàn)新的芽點。在40 Gy和60 Gy下基本停止分化，一周后，邊緣開始變黑，20 d后整體開始褐化，30 d后基本死亡。適當?shù)母鼡Q新鮮培養(yǎng)基可以延緩褐化過程，但對提高分化率沒有明顯效果。這表明用愈傷組織作為輻射材料相對于用種子作為輻射材料的輻射劑量要有所控制。劑量過高輻照后無法存活，而劑量太低則得不到足夠多的變異。為了進一步提高愈傷組織的存活率，而又保證一定量的變異發(fā)生，試驗嘗試了提高培養(yǎng)基的含糖量，取得了一定的效果，使得最終存活率達到了50%以上（表3）。根據(jù)半致死劑量是表示輻射育種適宜誘變劑量的標準[4]，可以認為20 Gy的吸收劑量是辣椒愈傷組織誘變處理較為適合的劑量。

圖1 輻射后有絲分裂中出現(xiàn)的連橋現(xiàn)象

表3 各個輻射劑量下愈傷組織的存活率

從試驗可以看出，誘導不定芽再生的效果經過輻射處理的愈傷組織，其分化能力也受到很大影響，不定芽和不定根的分化能力隨著輻射劑量的提高驟減；40 Gy以上的劑量使得愈傷組織基本失去分化能力，而對于已分化出芽的愈傷組織其根分化能力依然很強；在60 Gy的輻射劑量下，幾乎喪失分化能力，僅能維持幾周的生長時間（表4）。但適當?shù)奶岣逜gNO3的濃度對提高分化不定芽有一定的幫助。

表4 不同輻射劑量對愈傷組織誘導芽和根的影響

圖2 輻射對辣椒愈傷組織再生的影響

3 討論

要構建離體培養(yǎng)體系，篩選合適的激素組合是至關重要的。用無菌苗子葉作為外植體，反復篩選激素配方，構建較為高效的辣椒離體再生培養(yǎng)體系。一些研究者認為6-BA能有效促進不定芽的分化，但本研究發(fā)現(xiàn)僅添加6-BA對芽的誘導作用不大，與IAA按一定比例添加則可提高芽的誘導分化率，這表明不同辣椒品種對激素產生的效應不同。AgNO3能夠顯著促進芽的分化，添加濃度越高，不定芽的誘導率也越高，不過高濃度的AgNO3會造成植株生長畸形，這與賀曉慶[6]等的結論吻合。但本研究還發(fā)現(xiàn)，AgNO3能造成植株分叉增多、花期提前，這有利于提高辣椒產量，值得進一步研究。

[1] 陳文超.湖南辣椒發(fā)展狀況[J].辣椒雜志，2007，（2）：8-9.

[2] 馬艷青，張西露.湖南辣椒產業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展思考[J].湖南農業(yè)科學，2009，（12）：56-60.

[3] 邱 萃，何水林.辣椒組織培養(yǎng)再生體系的建立與應用[J].亞熱帶農業(yè)研究，2006，（2）:304-308.

[4] 詹亞光，唐敬軒，齊鳳慧.60Co-γ誘變對白樺愈傷組織再生的影響及再生植株染色體數(shù)量變異分析 [J].東北林業(yè)大學學報，2008，（1）:16-17.

[5] 黃 煒，鞏振輝.辣椒立體再生體系研究 [J].中國農學通報，2005，（12）:270-272.

[6] 賀曉慶，鞏振輝.不同辣椒材料離體再生及其影響因素的研究[J].西北植物學報，2007，27（7）：1329-1334.