李藍(lán)天，趙 勇，潘迎捷

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 203106）

表面形態(tài)觀察作為分子生物學(xué)研究的重要手段，是研究基因功能的基礎(chǔ)，也是了解基因功能的首要信息和重要依據(jù)。對于微生物來說，在逆境條件下基因組的表達(dá)量發(fā)生相應(yīng)變化，可能導(dǎo)致微生物的表面形態(tài)隨之發(fā)生一系列變化，因此對逆境條件下表面形態(tài)的觀察也是研究抑菌機(jī)理的重要手段。常用的觀察方法有普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡（負(fù)染）。副溶血弧菌（又稱嗜鹽菌 Vibrio Parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌或稍彎曲弧菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。該菌生活在海水中，可以由魚類、蛤、蚌類、甲殼類等水產(chǎn)動物中分離得到。為了真實反映菌的生長狀態(tài)，進(jìn)行外表面形態(tài)的觀察時要求盡可能維持菌體原貌，因此對樣品的制備過程的要求較高。為此，筆者針對上述幾種進(jìn)行表面形態(tài)觀察的技術(shù)方法，以副溶血弧菌為材料，進(jìn)行了樣品的收集、制備和觀察。并且根據(jù)觀察所得到的結(jié)果，比較各種方法的優(yōu)劣，并對操作過程中可能遇到的問題以及需要注意的事項分別進(jìn)行了闡述和說明。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 由本實驗室從海產(chǎn)品中分離得到，經(jīng)生理生化鑒定和16 s測序確定為副溶血弧菌。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑 供試儀器為相差顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡（JEM-7500F）、透射電子顯微鏡（JEM-2100）、CO2臨界點干燥儀、載玻片、蓋玻片等。供試試劑為吖啶橙、鋨酸固定液（鋨酸，戊二醛）、磷酸緩沖液（PBS，0.1 M，pH 7.4）、酒精、乙酸異戊酯、去離子水，磷戊酸等。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 實驗菌株接種在TSA斜面上，37℃培養(yǎng)20 h至長出單菌落，挑取任意單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中后，37℃搖床震蕩培養(yǎng)10 h。取10 μL菌懸液接種于新鮮TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)4～5 h至對數(shù)生長期，收集菌懸液，即為本實驗觀察所用材料。

1.2.2 相差顯微鏡觀察 用移液槍吸取少量菌懸液點在在玻片上，均勻涂開。然后蓋上蓋玻片，置于相差顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察（吖啶橙染色） 取正常狀態(tài)的菌懸液5 μL點在載玻片上。混勻，30 s后蓋上蓋玻片，要趕盡氣泡。然后置于熒光顯微鏡下，利用紫外光源并加濾光片，即可觀察拍照。

1.2.4 掃描電子顯微鏡觀察 （1）樣品的收集。取菌懸液 5～10 mL，8 000 rpm 離心 5 min，棄上清，重復(fù)此操作，將菌體收集到1.5 mL離心管中，得到樣品菌團(tuán)。

（2）漂洗與固定。磷酸緩沖液漂洗2次，每次將菌體重懸后8 000 rpm離心3 min使其重新聚集，以洗去多余的培養(yǎng)劑。加入戊二醛固定液并將菌體重懸于固定液中，4℃固定6～10 h。

（3）漂洗與后固定。磷酸緩沖液漂洗2次，每次重懸后靜置15 min再離心使其沉淀，以洗去多余的醛類物質(zhì)，以防醛類與鋨酸反應(yīng)。加入鋨酸固定液并將菌體重懸于固定液中，4℃后固定4～6 h。

（4）脫水與干燥。用磷酸緩沖液清洗沉淀3次，每次重懸后靜置20 min再離心使其沉淀。然后利用乙醇梯度脫水：30%、50%、70%、90%各1次。脫水過程中每次重懸后靜置15 min。再利用100%乙醇、乙酸異戊酯各重懸2次，每次20 min后利用臨界點干燥儀中進(jìn)行CO2臨界點干燥。

（5）觀察拍照。脫水干燥之后的樣品需要保存在干燥缸中，盡量干燥后一周內(nèi)進(jìn)行掃描電鏡的觀察。

1.2.5 透射電子顯微鏡負(fù)染 透射電鏡負(fù)染可用于觀察活菌。挑取生長在固體培養(yǎng)基上的菌落，用去離子水稀釋后點在銅網(wǎng)上。自然晾干或37℃烘干后，利用磷戊酸染色10 s，即可直接置于透射電鏡下觀察[1-2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 相差顯微鏡觀察

相差顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡在傳統(tǒng)微生物學(xué)研究中常用來菌落計數(shù)，其最大放大倍數(shù)為1 000倍。因此只能觀察到細(xì)胞的大體形態(tài)，不能用來觀察細(xì)胞表面的細(xì)微變化，相差顯微鏡與普通顯微鏡主要不同之處在于用環(huán)狀光欄代替可變光欄，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡及濾色片。這些特殊裝置能使活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本中各部分的折射率或厚度的微小差異產(chǎn)生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相差變成振幅之差，產(chǎn)生明暗變化，使人的肉眼能夠辨認(rèn)出來[3]。對于微生物而言，相差顯微鏡用于不染色或染不上色的細(xì)菌、螺旋體、真菌孢子等的快速辨認(rèn)，特別是對具有鞭毛、莢膜等特殊形態(tài)微生物的鑒別。相差顯微鏡由于制樣時沒有經(jīng)過染色或干燥等劇烈處理手段，所以保存了樣品最原始的狀態(tài)，而且可以觀察到樣品的運動狀況。圖1即為相差顯微鏡觀察的結(jié)果，可以觀察到副溶血弧菌的分裂狀態(tài)。

圖1 相差顯微鏡下的副溶血弧菌

2.2 熒光顯微鏡觀察

吖啶橙染色后的樣品在熒光顯微鏡下觀察的圖像相對清晰很多，并且由于吖啶橙也可以將DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂肪、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)染色，因此可以觀察到樣品的運動狀況和菌體細(xì)胞之間的連接現(xiàn)象以及外分泌物的狀況等。吖啶橙（Acridine Orange，AO）即 3，6－（二 甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式為 C17H19N3·HCl·ZnCl2，分子量為 438.12，是一種熒光色素，其檢測激發(fā)濾光片波長488 nm，阻斷濾光片波長515 nm。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。它與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光。吖啶橙與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，而與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體。因此吖啶橙能使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒；而壞死細(xì)胞的黃熒光會減弱甚至消失。圖2為副溶血弧菌吖啶橙染色后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。圖2a為正常生長的副溶血弧菌染色后的觀察結(jié)果，圖2b為某種逆境狀態(tài)下副溶血弧菌應(yīng)對外界環(huán)境壓力的反應(yīng)現(xiàn)象。

圖2 熒光顯微鏡下的副溶血弧菌

2.3 掃描電子顯微鏡觀察

冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡的放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬倍到數(shù)十萬倍，因此可以清晰地觀察到細(xì)胞表面的形態(tài)[4]。但是使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察時由于樣品的前處理過程中需要進(jìn)行反復(fù)多次的離心和重懸操作，會導(dǎo)致鞭毛會在前處理時幾乎全部脫落。因此對于長有鞭毛的菌體樣品來說，此類方法不適于鞭毛形態(tài)的觀察。同時外分泌物也會被洗脫，所以外分泌物狀態(tài)也無法進(jìn)行觀察。這一類顯微鏡要求樣品絕對干燥，因此需要在不改變樣品外觀形態(tài)的前提下，對樣品進(jìn)行一系列的脫水處理。要注意離心時轉(zhuǎn)速不宜過高，否則會對細(xì)胞形態(tài)造成破壞，一般采用8 000 r/min離心5 min即可，也可以降低轉(zhuǎn)速同時適當(dāng)延長離心時間。重懸菌體沉淀時如果采用移液槍吸打的方法也可能對菌體細(xì)胞造成破壞，所以盡量避免采用這種方法。但可以剪掉移液槍頭的尖端以減少對樣品的傷害。副溶血弧菌是一類嗜鹽畏酸菌，因此在樣品的前處理過程中，磷酸緩沖液要盡量調(diào)至與培養(yǎng)基相同的pH值和鹽度。圖3為掃描電鏡觀察副溶血弧菌的圖像。

2.4 透射電子顯微鏡觀察

透射電鏡負(fù)染的方法耗時短，所得到的結(jié)果非常接近樣品活體時的狀態(tài)。樣品的前處理非常簡單易行，對細(xì)胞的傷害很小，因此可以基本上保存鞭毛。而且透射電鏡的放大倍數(shù)高，因此可以對樣品進(jìn)行更細(xì)致的觀察[5]。但是該方法對樣品的要求比較嚴(yán)格，而且培養(yǎng)基中的鹽類和菌體的外分泌物等都會嚴(yán)重影響觀察效果，所以一般使用生長在固體培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行此類實驗的樣品制備。而液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體必須經(jīng)過離心和清洗后才能制備。單純此方法只能得到單個細(xì)胞的表觀形態(tài)的觀察圖像，對于需要統(tǒng)計表型數(shù)據(jù)的實驗并不適用。圖4是用透射電子顯微鏡負(fù)染觀察副溶血弧菌的圖像，箭頭指示即為鞭毛。

圖3 掃描電子顯微鏡下的副溶血弧菌

圖4 透射顯微鏡下的副溶血弧菌

3 總結(jié)

本實驗中采用了熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡（負(fù)染）觀察副溶血弧菌的表面形態(tài)。這些方法有各自適用的范圍，需要配合使用才能達(dá)到對菌體細(xì)胞進(jìn)行全面真實地觀察的目的。

試驗對比了四種觀察微生物表面形態(tài)的顯微觀察方法：相差顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡。這4種方法各有優(yōu)劣，并且都有各自適用的范圍。相差顯微鏡可以用于觀察菌體的運動狀況和單個菌體的大體形態(tài)，但無法觀察細(xì)胞的微小變化；熒光顯微鏡可用于細(xì)菌計數(shù)、區(qū)分正常細(xì)胞和死細(xì)胞以及菌體細(xì)胞之間的連接現(xiàn)象和外分泌物的宏觀情況等；掃描電子顯微鏡可觀察到菌體細(xì)胞表面的微觀形態(tài)，包括細(xì)胞壁褶皺等結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，但不適于鞭毛和外分泌物的觀察；透射電子顯微鏡（負(fù)染）可觀察細(xì)菌活體的形態(tài)，可以對鞭毛和外分泌物等進(jìn)行觀察，但是不適用于需要表型統(tǒng)計的實驗。

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