孫復(fù)錢 姚 琛 李新松 范凱紅 浦躍樸

(1東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,南京 210018)(2東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,南京 210018)

近年來(lái),靜電紡絲技術(shù)引起了研究者的極大興趣.靜電紡絲是通過(guò)在聚合物溶液中施加外電場(chǎng)來(lái)制造納米纖維的一種有效的紡絲技術(shù).靜電紡絲法制備的纖維直徑比普通紡絲方法所制得的纖維直徑小 100～1 000倍,通常在幾十納米到幾微米之間.通過(guò)電紡制備的納米纖維膜具有超大的比表面積,不僅可以用作高效過(guò)濾材料,而且在生物醫(yī)學(xué)材料、化學(xué)傳感器、防護(hù)材料、納米復(fù)合材料等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用前景[1-3].通過(guò)將具有催化、發(fā)光、吸附等功能的材料引入電紡納米纖維中,可以獲得具有特殊功能的納米纖維[4-5].采用冷凝-印跡[6]、相分離[7]等手段,還可以獲得具有納米多孔結(jié)構(gòu)等特殊幾何結(jié)構(gòu)的納米纖維.這些具有特殊結(jié)構(gòu)或功能的納米纖維將進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍.由于電紡纖維直徑與肌體細(xì)胞外基質(zhì)生物大分子材料的尺寸接近,將電紡納米纖維用作組織工程支架、防粘連膜、創(chuàng)面修復(fù)材料、人造血管等的研究尤為引人注目.

聚-L-乳酸(PLLA)類材料因其具有良好機(jī)械強(qiáng)度和較好的生物降解性能及生物相容性,在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域被廣泛地應(yīng)用,如生物可吸收骨折內(nèi)固定器、藥物釋放載體、可吸收外科縫合線等.Benjamin等[8]將聚乳酸等進(jìn)行電紡,所得到的納米纖維膜應(yīng)用于防止手術(shù)后組織粘連的研究.Mo等[9]將聚乳酸納米纖維應(yīng)用于組織工程支架研究.但是,聚乳酸納米纖維膜在體內(nèi)降解后生成酸性產(chǎn)物可能對(duì)機(jī)體帶來(lái)不良影響.β-磷酸三鈣(β-TCP)是一種重要的骨缺損修復(fù)材料[10],具有良好的生物相容性.將 PLLA與 β-TCP共電紡,有可能有效地控制 PLLA納米纖維降解產(chǎn)物導(dǎo)致的酸性環(huán)境.本文研究了PLLA/β-TCP復(fù)合物的電紡過(guò)程,探討了各種工藝條件對(duì)電紡納米纖維結(jié)構(gòu)的影響,制得了復(fù)合物納米纖維膜,并對(duì)其力學(xué)性能和體外細(xì)胞相容性進(jìn)行了初步研究,為 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜應(yīng)用于組織修復(fù)和再生奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

聚-L-乳酸(PLLA)：合成方法參照文獻(xiàn)[11],黏均分子量 Mη為 9.74萬(wàn).β-磷酸三鈣(β-TCP)：合成方法參照文獻(xiàn)[12],所得生料在 900℃下灼燒 4 h,以質(zhì)量比 1∶1.5的比例與一縮二乙二醇混合,在球磨機(jī)(南京大學(xué)儀器廠,QM-C1型)中研磨12 h,轉(zhuǎn)速 400 r/min,用丙酮替換出一縮二乙二醇即可獲得超細(xì) β-TCP(粒徑約 300 nm).其他試劑均為分析純.

1.2 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜的電紡

將 PLLA溶解于混合溶劑中(N,N-二甲基甲酰胺和丙酮的體積比 1∶1),配成質(zhì)量濃度為 0.05,0.1,0.15 g/m L的溶液,按 1∶20,2∶20,4∶20,10∶20 β-TCP/PLLA質(zhì)量比 (Wβ-TCP/WPLLA)加入 β-TCP超細(xì)粒子,超聲混勻.混合物在自動(dòng)電紡儀(東南大學(xué)生物材料和藥物釋放實(shí)驗(yàn)室自制)上進(jìn)行電紡,改變 PLLA溶液濃度 c、Wβ-TCP/WPLLA、噴頭與接收網(wǎng)之間的距離 d、加料速度等條件制得一系列復(fù)合物納米纖維膜,經(jīng)真空干燥除去溶劑.實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為 25℃,濕度為 60%.

1.3 結(jié)構(gòu)與性能表征

1)掃描電子顯微鏡觀察.將復(fù)合物納米纖維膜樣品剪成2mm×8mm條狀,經(jīng)表面噴金處理后用 Hitachi X-650型掃描電子顯微鏡(日本日立制作所,SEM)或 FEI Sirion場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(荷蘭菲利浦公司,FESEM)觀察形貌.根據(jù)掃描電鏡照片觀察測(cè)量至少 100根纖維的直徑,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2)力學(xué)性能測(cè)試.采用 INSTRON力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定不同 PLLA/β-TCP配比復(fù)合物電紡納米纖維膜的拉伸力學(xué)性質(zhì).樣條寬 5 mm,拉伸速率50mm/min,測(cè)試結(jié)果取平均值.

1.4 噻唑藍(lán)比色法(MTT)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜(Wβ-TCP/WPLLA為 0,1∶20,2∶20,4∶20)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡 20m in,滅菌消毒,置于 96孔板內(nèi),每組 3孔.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 L-929細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)基配制成 5×104個(gè)/m L均勻細(xì)胞懸液,分注于含樣品的 96孔塑料培養(yǎng)皿內(nèi),置于含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳空氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 72h.72 h后,每孔依次加入 20μL的 0.5%的 MTT液、80μL的無(wú)血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸去原液,加入每孔100μL二甲亞砜.震蕩 10min,在免疫酶標(biāo)儀上以575 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值.

細(xì)胞增殖率為

細(xì)胞抑制率為

式中,Aex為實(shí)驗(yàn)組測(cè)定的吸光度值;Aco為對(duì)照組測(cè)定的吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 電紡條件對(duì)納米纖維結(jié)構(gòu)的影響

PLLA/β-TCP復(fù)合物電紡的基本過(guò)程是使混合物溶液通過(guò)帶電的金屬噴頭,形成極細(xì)的液體流.液體流在高電壓作用下被拉伸并經(jīng)快速鞭動(dòng)形成納米纖維,由于納米纖維相互排斥,沉積在接收網(wǎng)上獲得纖維無(wú)規(guī)分散的 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜.在電紡過(guò)程中,溶液濃度、噴頭與接收網(wǎng)之間距離、溶液流速等條件對(duì)纖維的結(jié)構(gòu)和形態(tài)影響很大.

2.1.1 溶液濃度

圖 1是不同質(zhì)量濃度 PLLA/β-TCP溶液在Wβ-TCP/WPLLA為 4∶20,噴頭與接收網(wǎng)之間距離為 10 cm,溶液流速為 6m L/h的條件下電紡得到的復(fù)合物納米纖維膜的掃描電鏡照片.由圖可見(jiàn),隨著聚合物溶液濃度增加,纖維直徑增大.對(duì)應(yīng)地,圖2(a)、(b)、(c)為不同質(zhì)量濃度下電紡 PLLA/β-TCP纖維的直徑分布統(tǒng)計(jì)圖,溶液質(zhì)量濃度從0.05 g/m L增至 0.15 g/m L,纖維直徑 df顯著增加,分布 F也逐漸變寬.

圖1 不同 PLLA質(zhì)量濃度電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜的掃描電子顯微鏡照片

電紡過(guò)程中,溶液濃度對(duì)復(fù)合物納米纖維的形態(tài)和直徑有非常明顯的影響.溶液濃度很低時(shí),高分子線團(tuán)相互纏結(jié)很少,電紡時(shí)得不到連續(xù)的纖維,通常得到的是顆粒(照片未列出).溶液濃度較低時(shí),聚合物溶液的黏度也較低,盡管由于液體流所帶相同電荷的相互作用會(huì)使液體流的表面積盡可能的增加,并使液體流變得更細(xì).但是,當(dāng)黏度較低時(shí),表面張力仍然會(huì)使液體的表面積盡量縮小,使液體流形成一些球形結(jié)構(gòu),最終得到連珠狀纖維[13](見(jiàn)圖 1(a)).隨著濃度的增大,溶液的自身黏度會(huì)盡量使液體流保持原狀或減慢液體流形變的速度而使連珠體消失,得到直且均勻的纖維(見(jiàn)圖 1(b)).隨著濃度繼續(xù)增大,電紡纖維直徑增大(見(jiàn)圖 1(c)).

圖2 電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維的直徑分布圖

圖 3是不同 PLLA/β-TCP配比在 PLLA質(zhì)量濃度 0.1 g/mL,噴頭與接收網(wǎng)之間距離為 10 cm,溶液流速為 6 m L/h條件下電紡制備的復(fù)合物納米纖維膜掃描電鏡照片.單純 PLLA電紡納米纖維(見(jiàn)圖 3(a))輪廓分明、表面光滑.PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維表面出現(xiàn)斑點(diǎn)狀顆粒,且隨著 β-TCP含量增加,納米纖維表面顆粒逐漸增多(見(jiàn)圖3(b)～(e)),但 β-TCP的加入對(duì)納米纖維直徑影響不大.對(duì)比圖 2(b)和(d)相同 PLLA質(zhì)量濃度下不同 β-TCP含量的納米纖維直徑分布統(tǒng)計(jì)圖可以看出,不同 β-TCP含量的納米纖維的直徑分布幾乎一致.

為了進(jìn)一步考察纖維的精細(xì)結(jié)構(gòu)和 β-TCP在復(fù)合物納米纖維中的分散情況,采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)不同 β-TCP含量的復(fù)合物纖維進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖 4所示.從圖中可以清楚地看到纖維表面密布 β-TCP顆粒,當(dāng) β-TCP與聚合物質(zhì)量比為10∶20時(shí)最為明顯,β-TCP簇聚在纖維上形成了大量疙瘩(見(jiàn)圖 4(b)).表明 β-TCP的加入對(duì)電紡 PLLA納米纖維表面形貌有很大影響.

圖3 不同 Wβ-TCP/WPLLA電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜的掃描電子顯微鏡照片

圖4 不同 Wβ-TCP/WPLLA電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡照片

2.1.2 噴頭與接收網(wǎng)之間距離

改變噴頭與接收網(wǎng)之間距離,在 PLLA質(zhì)量濃度 0.1 g/m L,Wβ-TCP/WPLLA為 4∶20,溶液流速6m L/h條件下,電紡收集 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜掃描電鏡觀察結(jié)果如圖 5所示.可以看出,當(dāng)噴頭與接收網(wǎng)之間距離很小時(shí),纖維略有彎曲且較粗(見(jiàn)圖 5(a)),而且在成纖過(guò)程中,如果溶劑在較短的時(shí)間內(nèi)不能充分揮發(fā),還會(huì)導(dǎo)致纖維之間出現(xiàn)粘連;間距很大時(shí)接收到的纖維直徑較細(xì)(見(jiàn)圖 5(c)),這是因?yàn)橐后w流帶有同種電荷相互排斥,液體流快速鞭動(dòng),形成纖維并拉伸,上述過(guò)程經(jīng)過(guò)的路程越長(zhǎng),纖維拉伸越充分,且溶劑揮發(fā)越徹底,纖維的直徑越小.

圖5 不同噴頭與接收網(wǎng)間距電紡PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜的掃描電子顯微鏡照片

2.1.3 溶液流速

不同液體流速得到 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜的掃描電鏡照片如圖 6所示,可以看出纖維直徑隨著流速提高而增大.主要是因?yàn)楦吡魉傧乱后w流的直徑比低流速時(shí)大,這樣才能在相同時(shí)間內(nèi)噴射出更多的溶液.而經(jīng)過(guò)相同的路程,液體流快速鞭動(dòng)的過(guò)程可能大致相同,所以最終導(dǎo)致高流速時(shí)纖維直徑增大[14].

圖6 不同溶液流速電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜的掃描電子顯微鏡照片

2.2 電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜的力學(xué)性能

不同 PLLA/β-TCP配比的復(fù)合物納米纖維膜的拉伸力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表 1.結(jié)果顯示,復(fù)合物納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量都隨著β-TCP含量的增加而下降.當(dāng) β-TCP與 PLLA質(zhì)量比為 1∶20時(shí),復(fù)合物納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度比純 PLLA納米纖維膜降低了 20%左右,當(dāng) β-TCP與 PLLA質(zhì)量比達(dá) 10∶20時(shí),復(fù)合物納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度降至 7.034MPa.顯然,β-TCP粒子的加入降低了復(fù)合物納米纖維膜的力學(xué)性能,這可能是因?yàn)?β-TCP粒子在復(fù)合物納米纖維中分布不均,β-TCP與 PLLA之間相互作用較弱,成為納米纖維中的缺陷部分.但總體來(lái)說(shuō),PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜的力學(xué)性能都較好,完全滿足在組織工程支架、防粘連膜、創(chuàng)面修復(fù)材料等方面應(yīng)用的強(qiáng)度要求.

表1 電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物纖維膜力學(xué)性能 MPa

2.3 電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜的細(xì)胞相容性

通過(guò) MTT法以細(xì)胞增殖率對(duì)電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜進(jìn)行體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià),結(jié)果如表 2所示.結(jié)果表明,4種電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合納米纖維膜的細(xì)胞增殖率都大于 100%,具有良好的細(xì)胞相容性,根據(jù)細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷其細(xì)胞毒性都屬于 0級(jí),即無(wú)細(xì)胞毒性.表明電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜具有良好的生物相容性,可作為生物材料,有望在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域得到應(yīng)用.

表2 電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

利用靜電紡絲方法制得 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜,纖維直徑在 50 nm～3μm之間;電紡纖維的結(jié)構(gòu)與聚合物濃度、β-TCP與 PLLA質(zhì)量比、噴頭與接收裝置間距、溶液流速等因素有關(guān),其中聚合物濃度的影響最為明顯,調(diào)整這些參數(shù)可以得到不同組成、結(jié)構(gòu)的復(fù)合物納米纖維膜.電紡PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜具有良好的力學(xué)性能,其拉伸強(qiáng)度和楊氏模量隨著復(fù)合物中 β-TCP含量的增加而下降.電紡 PLLA/β-TCP復(fù)合物納米纖維膜對(duì) L-929細(xì)胞系無(wú)細(xì)胞毒性,有良好的細(xì)胞相容性,有望應(yīng)用于骨組織修復(fù)和再生領(lǐng)域.

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