呂 冰,高守一,萬(wàn)康林

自從1882年科赫發(fā)現(xiàn)結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌感染引起以來(lái),結(jié)核病一直是人類(lèi)想要攻克的傳染病之一。但是,經(jīng)過(guò)百年來(lái)人們的努力,結(jié)核病仍然是影響人類(lèi)健康的重要傳染病之一。在上世紀(jì)九十年代,以分子分型技術(shù)為基礎(chǔ)的分子流行病學(xué),給研究結(jié)核病病原特征、感染傳播和致病機(jī)制等提供了新的手段。尤其是結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組序列測(cè)序完成后,結(jié)核分枝桿菌的分子分型研究取得飛速的發(fā)展,進(jìn)入了一個(gè)全新的領(lǐng)域,也進(jìn)而使結(jié)核病流行病學(xué)的研究取得了很大的進(jìn)展。建立在基因序列基礎(chǔ)上的分子分型技術(shù)可以了解病例間的相互關(guān)系,使得流行病學(xué)研究中對(duì)病例的追溯更加直觀,易于了解結(jié)核病病原在人群中的傳播動(dòng)態(tài)特征。本文將介紹近年來(lái)國(guó)內(nèi)外經(jīng)常應(yīng)用的及新建立的結(jié)核分支桿菌分子分型研究的主要方法,包括插入序列6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、寡核苷酸多態(tài)性分析、長(zhǎng)片段多態(tài)性分析、富GC含量多態(tài)性、多位點(diǎn)可變數(shù)目重復(fù)片段多態(tài)性分析、以及單核苷酸多態(tài)性分析等。

1 插入序列6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

插入序列(Insert sequence,IS)是一種比較簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座元件,通常小于2.5kb,并且廣泛分布于大多數(shù)細(xì)菌的基因組中〔1〕。插入序列一般不會(huì)攜帶表型基因,而只帶有一些與其轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因,當(dāng)它們轉(zhuǎn)座到某一基因中使該基因失活或產(chǎn)生極性效應(yīng)時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)。插入序列位置的置換經(jīng)常會(huì)使基因斷裂,影響相鄰基因活性或是改變其表達(dá)〔1-2〕。從進(jìn)化的角度看,插入序列在基因組中的作用目前有兩種假設(shè)。其一是插入序列作為基因組中的“寄生者”,是對(duì)宿主的一種危害〔3〕;而另一種認(rèn)為插入序列是在細(xì)菌的進(jìn)化中起著重要的作用,保存宿主菌在自然選擇中產(chǎn)生的有利的變異〔4〕。

在結(jié)核分枝桿菌基因組中,作為分型應(yīng)用的插入序列包括IS6110和IS1081等,其中IS1081曾應(yīng)用到牛結(jié)核分支桿菌分型,而IS6110是最為重要和獨(dú)特的。Thierry等人最初報(bào)道IS6110序列為1355bp,隸屬于IS3家族,并且只存在于結(jié)核分枝桿菌基因組中〔5〕。這種插入序列廣泛分布于結(jié)核分枝桿菌的基因組中,在不同的臨床分離株中其重復(fù)次數(shù)也比較寬泛,為0-26個(gè)重復(fù)〔6-7〕,也有些文獻(xiàn)報(bào)道為0-25個(gè)重復(fù)〔8〕。不過(guò),IS6110片段在基因組中的分布并不是隨機(jī)的,有研究表明基因組中分布了一些IS6110插入的“熱點(diǎn)”〔6〕。IS6110插入位置和重復(fù)次數(shù)在不同菌株基因組中的多態(tài)性具有地域分布特點(diǎn),并且這種“標(biāo)識(shí)物”具有足夠的分辨力來(lái)區(qū)分不同的菌株。所以以IS6110分子分型為基礎(chǔ)的分子流行病研究被廣泛的應(yīng)用〔9〕。1993年,Van Embden等人介紹了IS6110限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)(IS6110-RFLP)分型法的標(biāo)準(zhǔn)操作方法〔10〕,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病分子流行病學(xué)的研究領(lǐng)域中。該標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作中的內(nèi)切酶應(yīng)用、分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照等細(xì)節(jié)進(jìn)行了明確的規(guī)范。試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化使得到的結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)成為可能,世界范圍內(nèi)的菌株追溯也成為可能。由于分型分辨率比較高,IS6110-RFLP方法目前依然被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核研究室也曾對(duì)IS6110-RFLP方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用的探討〔12〕。但是這種方法存在一定的局限性,如對(duì)IS6110低拷貝(拷貝數(shù)小于5)的菌株難以分型、操做技術(shù)繁瑣、雜交帶識(shí)讀困難等。

實(shí)驗(yàn)方法為:選用限制性?xún)?nèi)切酶PvuⅡ酶切菌株全基因組,經(jīng)瓊脂糖凝膠分離酶切后的基因組片段,轉(zhuǎn)至尼龍膜上,再由標(biāo)記過(guò)的探針雜交,放射自顯影技術(shù)檢測(cè)結(jié)果。為了實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)控,必須應(yīng)用內(nèi)對(duì)照及外對(duì)照。外對(duì)照選用Lambda/HindⅢ和PhiX174/HaeⅢ,內(nèi)對(duì)照選用Super Coiled Ladder DNA與PhiX174/HaeⅢ兩個(gè)核苷酸相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn),二者同被檢菌株一同用PvuⅡ酶切,外對(duì)照作為Marker單獨(dú)加樣,而內(nèi)對(duì)照與被檢的結(jié)核分枝桿菌DNA混合后一起電泳,內(nèi)對(duì)照與被檢DNA采用各自的探針?lè)謩e雜交(即雙雜交技術(shù))。該實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以 TIFF圖片格式儲(chǔ)存,用Bionumerics軟件分析結(jié)果〔10,12〕。

2 直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型

在結(jié)核分枝桿菌基因組中有一種36bp大小的DNA片段,在基因組中重復(fù)出現(xiàn),被稱(chēng)為直接重復(fù)片段(DR,Direct repeats),這些片段被35-41bp大小的間隔區(qū)分隔開(kāi),每個(gè)重復(fù)片段間的間隔區(qū)是唯一的,而且其順序在所有菌株幾乎是相同的,一個(gè)直接重復(fù)片段加上一個(gè)間隔區(qū)稱(chēng)為一個(gè)DVR(direct variant repeats),整個(gè)DR區(qū)是由多個(gè)DVR片段組成〔13〕。不同菌株會(huì)發(fā)生某一間隔區(qū)的插入或缺失,并且能穩(wěn)定傳代,針對(duì)檢測(cè)該間隔區(qū)的存在或缺失,利用間隔寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)方法就可以對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型鑒定。目前國(guó)際已有該方法的數(shù)據(jù)庫(kù)(SploDB4),該數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收錄了全世界122個(gè)國(guó)家的39295株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的Soligotyping分型數(shù)據(jù)〔14〕,在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核病研究室也建立了中國(guó)Spoligotyping數(shù)據(jù)庫(kù),并收錄全國(guó)2千多株臨床分離株的Soligotyping分型數(shù)據(jù)(論文待發(fā)表)。

結(jié)核分枝桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型方法是一種獨(dú)特的以PCR為基礎(chǔ)的分子分型方法〔15-16〕。這種方法目前已經(jīng)有標(biāo)準(zhǔn)操作,中國(guó)疾控中心傳染病所結(jié)核研究室也有關(guān)于此方法的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用探討〔17〕。該方法選取結(jié)核分枝桿菌基因組DR序列間的間隔區(qū)序列,設(shè)計(jì)各自特異的寡核苷酸探針,并固定在Biodyne C膜上,用生物素標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增被檢菌株的間隔區(qū)序列,將帶有標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上結(jié)合的寡核苷酸探針雜交,再通過(guò)ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)〔18〕,得到較為特異的結(jié)果。結(jié)果判斷雜交陽(yáng)性即間隔區(qū)存在用“1”表示,陰性即間隔區(qū)缺失用“0”表示,這樣每間隔區(qū)的檢測(cè)結(jié)果就獲得0或1的數(shù)字編碼,用 BioNumerics軟件進(jìn)行結(jié)果分析〔17〕。

該方法同IS6110-RFLP相比有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn),一是不需大量的菌株DNA,二是結(jié)果為數(shù)字編碼,便于分析。但是缺點(diǎn)也不容忽視,即該方法的分辨率比較低〔19〕,尤其是對(duì)北京家族菌株。

3 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列及MLVA分型

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeats,VNTR),又稱(chēng)為分枝桿菌分散重復(fù)單元(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU),廣泛存在于原核和真核生物的基因組中。近似于哺乳動(dòng)物基因組中的微衛(wèi)星區(qū)域〔20〕。在已完成全基因組測(cè)序分析的結(jié)核分枝桿菌 H37Rv、CDC1551、和AF2122/97菌株基因組中均富含VNT R,并且許多臨床分離菌株的研究中證實(shí),不同VNTR位點(diǎn)在同一菌株中、同一VNTR位點(diǎn)在不同菌株間,其重復(fù)單元的拷貝數(shù)不同,即存在明顯的多態(tài)性〔21-24〕,但其側(cè)翼序列具有高度保守性。自1998年Forthingham和Meeker等人報(bào)道結(jié)核分枝桿菌基因組中的VNT R位點(diǎn),并且發(fā)現(xiàn)了11個(gè)具有基因多態(tài)性的位點(diǎn)(5個(gè)MPT R及6個(gè)ETR位點(diǎn))〔25〕之后,更多關(guān)于VNTR 的研究被陸續(xù)的報(bào)道出來(lái)。被檢測(cè)的菌株根據(jù)不同位點(diǎn)的VNTR重復(fù)單元的拷貝數(shù)的多少來(lái)進(jìn)行數(shù)字化編碼,然后利用相關(guān)軟件通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)對(duì)這些菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析〔25〕?；静僮鞣椒ㄊ?常規(guī)培養(yǎng)菌株,水煮法制備樣品DNA,PCR擴(kuò)增選取的位點(diǎn)片段,瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產(chǎn)物的大小,確定位點(diǎn)的串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù),所有位點(diǎn)的重復(fù)序列次數(shù)可成為該菌株的數(shù)字編碼,用 BioNumerics軟件聚類(lèi)分析〔26〕。2000年Supply等人確認(rèn)了41個(gè)VNTR位點(diǎn),經(jīng)過(guò)研究分析選擇了其中的12個(gè)位點(diǎn),用該方法分型結(jié)果每株菌株以12個(gè)數(shù)字標(biāo)記,采用數(shù)字化結(jié)果進(jìn)行細(xì)菌的分子分型〔20〕。目前Supply等人又建立了VNTR(MIRU)分析網(wǎng)站,在該網(wǎng)站中全世界菌株的VNTR位點(diǎn)數(shù)據(jù)都可進(jìn)行比對(duì)〔27〕。

多個(gè)VNT R位點(diǎn)組合的分型技術(shù)稱(chēng)為多位點(diǎn)VNTR分析(Multiple Loci VNT R Ananlisis,MLVA)。MLVA的分辨率取決于所選擇的位點(diǎn)及位點(diǎn)數(shù)量。一般來(lái)說(shuō)當(dāng)選擇12個(gè)位點(diǎn)時(shí),分型分辨率較IS6110低,但是12個(gè)位點(diǎn)與 Spoligotyping合并分型,或是應(yīng)用 15個(gè)位點(diǎn),其分型分辨率較IS6110 高〔28〕。

該方法操作簡(jiǎn)單,分辨率高,結(jié)果容易分析,具有很高的可重復(fù)性,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間具有非常好的可比性,并能提供數(shù)字化的分型信息,適宜于進(jìn)行大量樣本和網(wǎng)絡(luò)化分析〔29〕。這種結(jié)果數(shù)字化的特點(diǎn),更有利于分析及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的質(zhì)控。同IS6110-RFLP方法相比有著很大的優(yōu)勢(shì),在以后很有可能取代IS6110-RFLP方法成為新的金標(biāo)準(zhǔn)〔30〕。美國(guó)疾病控制中心已建議作為結(jié)核分枝桿菌基因型分型的首選方法〔31〕。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核病研究室通過(guò)對(duì)VNT R位點(diǎn)分析,對(duì)北京、安徽、福建、西藏各省市自治區(qū)的菌株進(jìn)行分型研究〔21-24〕,確定了15個(gè)位點(diǎn)的ML-VA分型操作作為中國(guó)結(jié)核分枝桿菌MLVA分型的標(biāo)準(zhǔn)化操作〔26〕。

4 單核苷酸多態(tài)性和MLST分型

隨著全基因組序列分析技術(shù)的快速發(fā)展,結(jié)核分枝桿菌基因組間的比對(duì)也成為了可能。在核酸水平的基因多態(tài)性使研究者發(fā)現(xiàn)要研究不同臨床分離株的進(jìn)化差異,單核苷酸的變異也可以成為新的基因標(biāo)志物。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)包括非同義SNP,和同義 SNP。非同義SNP是指核酸的改變引起了氨基酸的變化,可能是細(xì)菌適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境選擇壓力產(chǎn)生的變異,例如耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變;同義SNP是指核酸的改變沒(méi)有產(chǎn)生氨基酸的改變,這種中性的變異尤其是發(fā)生在結(jié)構(gòu)相關(guān)基因或是管家基因,能夠?yàn)榫觊g的進(jìn)化相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Sreevatsan等人發(fā)現(xiàn)DNA促旋酶亞基的編碼基因上第95密碼子和一種過(guò)氧化物酶觸酶編碼基因的463密碼子的非同義SNP可以使結(jié)核分枝桿菌分至3種主要的基因群(PGGs)中〔32〕。

多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)是基于病原微生物管家基因位點(diǎn)上的SNP建立的分型方法,通過(guò)確定管家基因并且直接測(cè)定這些管家基因的核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)不同菌株在這些序列上的差異進(jìn)行分型研究。現(xiàn)在已經(jīng)有MLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(www.mlst.net),建立了十幾種病原的MLST數(shù)據(jù),但是尚沒(méi)有結(jié)核分枝桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù),亟待研究工作者的完善。

5 長(zhǎng)片段多態(tài)性

對(duì)基因組的比對(duì)分析除了得到基因組間SNP差異以外,也揭示了基因組間的長(zhǎng)片段多態(tài)性(large-sequence polymorphisms,LSP)。LSP的產(chǎn)生可能是由于基因組大片段的基因缺失或重排,而不是由于基因間的水平轉(zhuǎn)移〔33〕。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)臨床分離株基因組中大約 4.2%基因會(huì)發(fā)生缺失〔34〕。Brosch等人發(fā)現(xiàn)大片段的缺失一旦出現(xiàn),絕大多數(shù)會(huì)遺傳到子代基因組中。所以特定的LSP也會(huì)成為研究菌株分型進(jìn)化的基因標(biāo)識(shí)物,目前對(duì)LSP的研究主要集中于分枝桿菌的進(jìn)化研究。例如 TbD1片段的缺失可以確定結(jié)核分枝桿菌的現(xiàn)代型,同樣擁有這一片段的菌株被稱(chēng)為是結(jié)核分枝桿菌的古典型〔35〕。LSP并不是隨機(jī)發(fā)生在全基因組,而是有聚集傾向,也就是說(shuō)一些位點(diǎn)可以是DNA缺失的“熱點(diǎn)”。而且有些熱點(diǎn)同插入序列的轉(zhuǎn)移有關(guān)系〔34〕。

一些LSP對(duì)于疫苗及結(jié)核感染檢測(cè)的研究具有重要的作用,例如M.bovis、BCG基因組中一些片段的缺失可以成為疫苗研究的突破口,而一些片段包含分泌蛋白的編碼基因,這樣的片段缺失可以提示我們菌株的毒力或引起的機(jī)體免疫能力產(chǎn)生差異。

表1 幾種分型方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

6 小 結(jié)

結(jié)核病分子流行病研究是一個(gè)很大的范疇,包括分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)及流行病學(xué)幾種學(xué)科的聯(lián)合應(yīng)用,是從基因水平了解菌株親緣關(guān)系,研究結(jié)核病的病原分子特征、遺傳變異機(jī)制、人群中傳播規(guī)律及危險(xiǎn)因素等。其核心技術(shù)是分子分型技術(shù)。在過(guò)去的近十年里,分子分型技術(shù)在不同地區(qū)的結(jié)核病流行研究中起到了重要的作用,使研究者對(duì)于結(jié)核病流行動(dòng)態(tài)特征的了解、對(duì)于各地區(qū)疾病流行趨勢(shì)的掌控、從而起到了對(duì)結(jié)核病預(yù)防控制的作用。近年來(lái)結(jié)核病流行病學(xué)研究中又有新的問(wèn)題出現(xiàn),HIV合并感染、耐藥及多耐藥菌株的出現(xiàn),使得研究工作者的任務(wù)更加艱巨。

在各種分型方法中,目前IS6110-RFLP、Spoligotyping及MLVA三種方法是在國(guó)際上流行病研究實(shí)際工作中最經(jīng)常使用的方法,并且在各國(guó)的疾控工作中起到了重要的作用,也已經(jīng)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作方法發(fā)表,而且Spoligotyping和MLVA方法都有國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站,有利于各個(gè)國(guó)家研究者發(fā)布或比對(duì)數(shù)據(jù)。理想的分型方法應(yīng)具有快速、分辨率高、重復(fù)性好、容易操作、費(fèi)用低廉等特征,但是現(xiàn)有的方法沒(méi)有一種能完全符合以上條件,都是各具有自己的優(yōu)點(diǎn),又各自有其不足之處(表1是幾種分型方法優(yōu)缺點(diǎn)比較)。在研究工作中我們無(wú)法提供一種完美的分型方法,但是不同種方法的聯(lián)合應(yīng)用可以盡可能達(dá)到我們要求的結(jié)果,IS6110-RFLP方法耗時(shí)長(zhǎng),不適于大流行中樣本的快速鑒定,而Spoligotyping和MLVA方法快速簡(jiǎn)便,適用于大量樣本的快速鑒定,所以這兩種方法聯(lián)合應(yīng)用比較多見(jiàn)。在我國(guó)北京、安徽、福建、西藏各省市自治區(qū)的菌株的分型研究中都有應(yīng)用〔21-24〕。

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