林雪群,萬麗丹,薛國勇,祝高春,楊 剛

腦血吸蟲病是人體感染血吸蟲后,血吸蟲侵犯到腦部血管,蟲卵的分泌和排泄產(chǎn)物通過血管內(nèi)皮細胞進入腦內(nèi),沉積在腦組織中,形成蟲卵肉芽腫、假性結(jié)核結(jié)節(jié)或瘢痕結(jié)節(jié),其毒素作用導(dǎo)致腦水腫、腦軟化,造成腦組織一系列病理改變〔1〕。腦血吸蟲病的病理機制一直是許多學(xué)者長期關(guān)注的問題,有學(xué)者認為血吸蟲蟲卵激活內(nèi)皮細胞的機制除涉及到細胞內(nèi)信號的改變外〔2〕,還可能和內(nèi)皮細胞間的縫隙連接緊密相關(guān)。因此,我們研究和觀察腦血吸蟲病腦血管壁縫隙連接蛋白的表達和分布,為探查腦血吸蟲病的發(fā)病機理提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 兔腦血吸蟲病模型制作 New Zealand大白兔10只,2.0～2.5kg,雌雄不拘,1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)行耳緣靜脈注射麻醉后,固定在立體定位儀上,暴露顱骨,在前囟前5 mm和右外側(cè)3 mm鉆一直徑為2 mm骨孔,在額極挑破腦膜,將內(nèi)徑0.1 mm的PE-10管向下向后沿皮層表面方向插入1 mm,管腔中可抽到清亮腦脊液,證明位于蛛網(wǎng)膜下腔,再將塑料管插入腦內(nèi)3mm深,可見管內(nèi)有腦脊液返流,通過塑料管向顱內(nèi)注射血吸蟲蟲卵懸液0.2mL(約含蟲卵5 000個),然后用502膠水封住骨孔,縫合頭皮,衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)。

1.2 間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)腦血吸蟲病模型實驗動物術(shù)后存活30d,在1%戊巴比妥鈉40mg/kg行耳緣靜脈注射麻醉下,抽血和腦脊液作間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)驗證。

1.2.1 間接血凝抑制試驗(IHA) 按間接血凝抑制試驗試劑盒(江西省血吸蟲病防治研究所購置)說明書進行,具體操作如下:

在血凝板的第1孔至第8孔各加2%NRS 50μL(取pH7.6、0.01mol/LPBS 98 mL,滅能兔血清 2mL,于4℃冰箱保存即成2%NRS液),用移液器取待檢血清50μL,加第1孔混勻,并從中取出50μL加入第2孔混勻后取出50μL加入第3孔,同樣操作直到第8孔混勻后棄去50μL,然后每孔各加抗原 25μL,稀釋過程中嚴防吸頭的互相接觸和相鄰孔內(nèi)液體相互污染。振蕩1 min室溫下(15℃以上)靜置1.5～2h。觀察待檢血清各孔的凝集程度,以呈“++”凝集的被檢血清最大稀釋度為其血凝效價(血凝價)。血清的血凝價達到1∶16為免疫合格。

取陰性血清和陽性血清分別作陰性對照和陽性對照。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作:按血吸蟲抗體ELISA檢測試劑盒(深圳市康百得生物科技有限公司購置)說明書操作,具體操作如下:抗原用包被液(0.2 mol/L Na2CO38 mL,0.2 mol/L NaHCO317 mL,加75 mL蒸餾水,調(diào)pH 至9.6)稀釋至10μ g/mL;以 100μL/孔量加入酶標(biāo)板孔中,置 4 ℃過夜;棄去孔內(nèi)的液體,同時用洗滌液(KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,NaCl 8.0g,Tween-20 0.5 mL,加蒸餾水至1 000 mL,pH7.2)洗3次,每次 5 min;每孔加 200μL封閉液(5%脫脂乳)4℃過夜;洗滌液洗3次;每孔加50μL不同稀釋度的待檢血清,同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照;37℃孵育 1 h,洗滌,拍干;加H RP標(biāo)記的羊抗兔IgG,每孔50μL,37 ℃孵育 1 h,洗滌,拍干;加底物液,每孔加新鮮配制的底物使用液(OPD 5 mg,底物緩沖液 10 mL,30%H2O240μL)100μL,37 ℃10-30 min;以 2 mol/L H2SO450μL 終止反應(yīng)。

1.2.3 結(jié)果判斷 肉眼觀察:在白色背景下觀察各孔顯色情況,陰性對照無色,陽性對照呈明顯黃色,表示試驗有效。待檢孔無色表示該標(biāo)本為陰性,待檢孔呈黃色表示該標(biāo)本為陽性。酶標(biāo)儀測定:以空白對照調(diào)零用酶標(biāo)儀于450nm(620nm作參比波長)讀取OD值,待檢孔OD值大于陰性對照2.1倍者為陽性。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA的表達 10只腦血吸蟲病模型兔作為實驗組;10只New Zealand大白兔作為對照組。各組實驗動物1%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射(50 mg/kg),麻醉后開顱取基底動脈血管組織,于冰浴的kerbs液中小心剝離其上粘附的蛛網(wǎng)膜,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 組織總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用異硫氰酸胍一步法,取腦基底動脈血管組織100 mg標(biāo)本組織,加入預(yù)冷的 Trizol變性液1mL(洛陽華美生物工程公司購買),在玻璃勻漿器中冰上勻漿,靜置5 min,其余步驟嚴格按Trizol提取液說明書操作。所得總RNA溶解于無RNase水中。取部分總RNA用紫外分光光度計(Bankman USA DU-640型)進行定量和純度測定,用2%凝膠電泳檢查其完整性,其余-70℃保存待用。取總 RNA 5μL,在20μL體系中以Random hexamer perimr為引物,應(yīng)用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA。具體反應(yīng)體系為:總 RNA 5μL 與 ribonuclease 抑制劑 0.5μL,Random hexamer perimr 1μL,65℃,5 min。然后加入第1鏈緩沖液 5μL,ribonuclease抑制劑0.5μL,dNTP混合液2μL,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,37℃水浴1h,90℃水浴5 min。反應(yīng)完后,迅速冰上冷卻,室溫高速離心5 s,-20℃保存。

1.3.2 PCR擴增反應(yīng) 取5μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,依次加入下述組分:10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL,dNTP混合液(2.5mmol/L)4μL,Taq DNA聚合酶1μL,Cx37 上、下游引物各 0.5μL,β-actin 上、下游引物各0.5μL,加無菌雙蒸水至50μL,在PCR 合成儀中進行。實驗所用引物序列為:Cx37:(antisense)5′-GAC TGG GGC TTC CTG GAG AAG-3′,(sense)5′-GCC ACC GAG ATC T TG GCC ATC-3′,可擴增長413bp 的 cDNA 片段;β-actin:5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3′,5′-ATC ATG T T T GAG ACC T TC AAC A 3′,可擴增長308 bp的cDNA片段。開始用92℃2 min,然后循環(huán)參數(shù):92℃50 s,550C 45 s,72℃60 s,共30個循環(huán),最后一個循環(huán)在62℃延伸7 min。

1.3.3 擴增產(chǎn)物的電泳分析 10μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離,紫外透射分析儀觀察后照相,凝膠圖象分析系統(tǒng)對PCR的產(chǎn)物進行定量。以Cx37 mRNA擴增帶的光密度與β-actin擴增帶的光密度的比值代表細胞中mRNA的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 10.0進行方差分析及Student-Newan-Keuls法分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 血和腦脊液間接血凝抑制試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 檢測結(jié)果見表1和表2。血和腦脊液IHA和ELISA檢測結(jié)果表明腦血吸蟲病模型建立良好。

表1 血清免疫學(xué)檢查Table 1 Immunological assay for serum

表2 腦脊液免疫學(xué)檢查Table 2 Immunological assay for cerebral spinal fluid

2.2 RT-PCR法檢測腦血吸蟲病腦基底動脈Cx37 mRNA表達 所有樣品的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間,表明總RNA純度較高,沒有蛋白質(zhì)的殘余,質(zhì)量可靠。總 RNA變性瓊脂糖電泳結(jié)果顯示28S、18S、5S條帶均較為清楚(見圖1),提示RNA提取較為完整、無降解。RT-PCR結(jié)果顯示,正常兔腦基底動脈表達 Cx37 mRNA與 β-actin mRNA的比值為0.607±0.071,腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達比值為1.370±0.095,與正常組比較增加了近3倍,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗具有顯著性差異(P＜0.05)(見圖2,3)。

圖1 兔腦血吸蟲病腦基底動脈Cx37總RNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis results of Cx37 total RNA in basilar artery of rabbits cerebral schistosomiasis

3 討 論

血吸蟲侵入體內(nèi)經(jīng)血循環(huán)感染到肺、肝臟和腸道組織引起血吸蟲病,已被許多學(xué)者所公認〔3〕;關(guān)于肺血吸蟲、肝血吸蟲的動物模型早已被許多學(xué)者研究所應(yīng)用。但是,由于腦血吸蟲病的動物模型一直難以制作,從而使腦血吸蟲病發(fā)病機理的研究受到極大的限制,尤其是蟲卵究竟經(jīng)過什么途徑到達顱內(nèi)?又是怎樣經(jīng)過腦動脈沉積于腦組織這一關(guān)鍵而又重要的問題一直備受人們的關(guān)注。

根據(jù)縫隙連接的生物特性及其作用,我們設(shè)想縫隙連接可能參與了腦血吸蟲病的病理發(fā)生,在內(nèi)皮細胞間隔的縫隙連接中,蟲卵及其分泌物與內(nèi)皮細胞的相互接觸是否可能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮縫隙連接蛋白的上調(diào),不僅可以影響宿主的免疫反應(yīng),而且可能涉及血管內(nèi)皮屏障的滲透性,從而使蟲卵及其分泌物經(jīng)血管內(nèi)皮細胞溢出,沉積于腦組織而形成炎癥性肉芽腫,引發(fā)腦血吸蟲病。因此,從細胞和分子水平深入研究縫隙連接蛋白參與腦血吸蟲病的分子機制,探討血吸蟲卵沉積于腦組織的途徑和機理,探索腦動脈縫隙連接蛋白在腦血吸蟲病發(fā)病機理中的作用,為進一步探討腦血吸蟲病的防治措施有著重要的意義。

縫隙連接是由2個位于相鄰細胞膜上互相對應(yīng)的半通道(hemichannel)組成,中間相隔2 nm,每個半通道是由縫隙連接蛋白六聚體結(jié)構(gòu)圍繞一個水相通道排列而構(gòu)成連接小體(Connexon);連接小體中間的管道對接而聯(lián)通相鄰細胞胞漿形成GJ通道〔4〕。Cx基因家族編碼一大類膜蛋白,由許多成員組成,其中至少有12種Cx,但參與體內(nèi)血管壁細胞間GJ構(gòu)成的連接蛋白類型主要有三種〔5〕,它們分別為Cx37、Cx43和 Cx40;血管內(nèi)皮細胞以表達Cx37為主,平滑肌細胞以表達Cx43和Cx40為主。已有的研究〔6〕主要針對體內(nèi)較大的彈力血管組織的研究,如主動脈、腸系膜動脈等。體內(nèi)一些小動脈,如腦基底動脈等,對這些小動脈管壁上連接蛋白的表達和分布目前尚不清楚,尤其是在腦血吸蟲病病理情況下,血管內(nèi)皮細胞及胞間通透性的改變,可能涉及腦動脈管壁上縫隙連接蛋白的表達和分布發(fā)生變化。

我們通過觀察發(fā)現(xiàn),腦血吸蟲病兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達較正常兔腦基底動脈Cx37 mRNA表達明顯升高,約是正常兔的3倍,可見腦血吸蟲病兔腦血管壁細胞的縫隙連接結(jié)構(gòu)的分布有其獨特性。GJ的主要功能是參與細胞間信息傳遞和細胞功能活動的協(xié)調(diào);參與細胞的分化、生長與發(fā)育;細胞可通過GJ向周圍細胞排出代謝產(chǎn)物,減少毒物對細胞的損害,細胞還可通過GJ向周圍細胞提供其所需的營養(yǎng)物質(zhì)〔7〕。實驗結(jié)果提示腦血吸蟲病兔腦基底動脈高表達的Cx37 mRNA,可能涉及腦血管細胞間信息傳遞和細胞功能活動的改變,涉及血管內(nèi)皮屏障的滲透性,從而使蟲卵及其分泌物便于經(jīng)血管內(nèi)皮細胞溢出,沉積于腦組織而誘發(fā)腦血吸蟲病。其確切的功能和和致病機制有待更深入的研究。

縫隙連接作為細胞進行信息交流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),參與腦血管組織的生理和病理過程。對腦血吸蟲病腦血管壁縫隙連接蛋白的深入研究,將有利于揭示縫隙連接蛋白和腦血吸蟲病之間的聯(lián)系,有利于闡明腦血吸蟲病的傳播途徑及發(fā)病機理,為進一步探討腦血吸蟲病的預(yù)防和治療措施提供形態(tài)學(xué)資料。

〔1〕蔣忠銘.腦血吸蟲病的M R診斷〔J〕.實用醫(yī)技雜志,2004,11(2):132-133

〔2〕T rottein F,Descamps L,Nutten S,et al.Schistosoma mansoni activates host microvascular endothelial cells to acquire an antiinflammatory phenotype〔J〕.Infection and Immunity,1999,67(7):3403-3409

〔3〕Hanna LS,Medhat AM,Abdel-Menem HA.Biochemical changes after subchronic and chronic interaction of Schistosoma mansoni infection in Swiss albino mice with two specific compounds〔J〕.J Egypt Soc Parasitol,2003,33(1):245-260

〔4〕Antonio DM,Virginia L.Gap junctions,homeostasis and injury〔J〕.J Cell Phy siol,2002,191:269-282

〔5〕Seul KH,Beyer EC.Mouse connexin 37 gene structure and promoter an lysis〔J〕.Biochem Biophys Acta,2000,1492(2):499-504

〔6〕Pollmann MA,Shao Q,Laird DW,et al.Connexin 43 mediated gap junctional communication enhances breast tumor cell diapedesis in culture outline〔J〕.Breast Cancer Research,2005,7:522-534

〔7〕Kurjiaka DT,Steele TD.Gap junction permeability is diminished in proliferating vascular smooth muscoe cells〔J〕.Am J Physiol,1998,275:1674-1682