何秀婷，李 瀟，楊永濤，2，李凱彬，李桂英，聶湘平

(1．暨南大學水生生物研究所，廣東 廣州 510632；2.濟寧學院生命科學與工程系，山東 曲阜 273155；3．中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣東 廣州 510380；4．中國科學院地球化學研究所，廣東 廣州 510640)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)是一類應用廣泛的人工合成工業(yè)有機化合物質，主要用作為增塑劑，以提高產品的可塑性和強度，也普遍用于農藥、涂料、印染、油漆、化妝品、香料和生活用品的生產。由于PAEs極易遷移進入環(huán)境，且難以降解，隨著塑料橡膠制品的廣泛應用，在大氣、水體、土壤、生物體乃至人體都發(fā)現(xiàn)PAEs的存在[1-2]。研究表明PAEs類化合物具有雌激素作用，能夠干擾人體內正常的內分泌從而影響生殖[3-4]；也有研究報道該類化合物存在致癌 、致畸、致突變和致哮喘的作用[5-6]。美國國家環(huán)保局(US EPA)將鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate, DMP), 鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate, DEP), 鄰苯二甲酸二正丁酯(Dibutyl phthalate, DBP), 鄰苯二甲酸丁基芐基酯(Butylbenzyl phthalate, BBP), 鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate, DOP), 鄰苯二甲酸二異辛酯(Di-(2-etylhexyl) phthalate, DEHP) 6種 PAEs化合物列為優(yōu)先控制的有毒污染物[7]，我國也將DEP、DMP和 DOP 3種PAEs化合物確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[8]。目前，對鄰苯二甲酸酯類化合物的研究主要集中在單一污染物的毒性效應。而實際上這幾種化合物常常是同時存在于環(huán)境中，生物體更多是處在這些化合物的混合暴露中。本研究以斑馬魚為模式生物，選擇了4種養(yǎng)殖魚體內被普遍檢出的鄰苯二甲酸酯類化合物[9]，即DMP、DEP、DBP和DEHP，探討它們在斑馬魚胚胎發(fā)育過程的單一毒性和聯(lián)合毒性效應，為這類物質風險管理提供有效的毒理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實驗選用以4種鄰苯二甲酸酯類：DMP、DEP、DBP和DEHP，均為分析純，購于美國Accu Standard，INC。助溶劑丙酮為國產分析純。

試驗儀器包括; 倒置光學顯微鏡、可控光、控溫循環(huán)水族箱、光照恒溫培養(yǎng)箱和24孔細胞培養(yǎng)板。

1.2 實驗動物

將成年斑馬魚(雌雄魚數(shù)量比約為2∶1)斑馬魚飼養(yǎng)在經活性炭過濾并充分曝氣的水體內，水體pH 8.34，總硬度為28～32 dH，保持(26±1)℃，光照/黑暗周期14 h/10 h，進行馴養(yǎng)。每日喂食2次經紫外消毒處理過的冷凍魚食搖蚊幼蟲(來自非污染環(huán)境，經檢測四種受試化合物的含量低于檢測限)。 根據(jù)Nagel法收集受精卵[10]。 魚卵收集后，用水迅速清洗除去殘留物，在倒置顯微鏡下挑選出分裂正常的受精卵，進行毒性試驗。實驗用水是曝氣24 h以上的自來水。實驗中空白對照組、溶劑對照組(0.1%丙酮)及處理組各設置三個平行。

1.3 實驗方法

1.3.1 單一毒性實驗 按照OECD[11]指南設計胚胎毒性試驗。測試化合物的丙酮儲備液用純凈水配制成水溶液，母液中的丙酮體積分數(shù)不超過0.3%，受試液中丙酮的體積分數(shù)不超過0.1%。開始實驗前，分別配制4種PAEs 的5組質量濃度(DMP: 2.50, 5.00, 10.0, 20.0, 40.0 mg/L； DEP: 0.75, 1.50, 3.00, 6.00, 12.0 mg/L； DBP: 0.075, 0.15, 0.30, 0.60, 1.20 mg/L；DEHP: 0.250, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00 mg/L)備用。選用24孔多孔板，每孔的容積為3 mL，實驗時每孔加入2 mL試液，放一枚受精卵。每張多孔板為一個實驗濃度組，同時進行空白對照組和溶劑對照組(φ=0.1%丙酮)。鋁箔封面以避免蒸發(fā)改變實驗濃度。將密封好的多孔板放在溫度恒定為(26±1)℃的光照培養(yǎng)箱中孵化。在倒置顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，記錄發(fā)育過程中一些具有代表性的毒理學終點[12]，并記錄48 h胚胎死亡數(shù)，用概率單位法計算48 h LC50值。

1.3.2 聯(lián)合毒性試驗 在已測得48 h半數(shù)死亡質量濃度(LC50)的基礎上，每種化合物設定高、中、低3個實驗質量濃度(見表1)，考慮到各因素之間可能存在的聯(lián)合交互作用，采用四因素三水平L27(313)正交表把試驗分為27組，每組設3個平行，測試各混合物對斑馬魚胚胎的毒性效應，并記錄各試驗組48 h的胚胎死亡數(shù)、孵化數(shù)和畸形數(shù)。

表1 4種鄰苯二甲酸酯混合暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的正交試驗因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)處理

單一毒性試驗根據(jù)胚胎48 h的死亡數(shù)，用概率單位法計算48 h半致死質量濃度(LC50-48)。聯(lián)合毒性試驗中考慮4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中單因素和兩兩交互作用對斑馬魚胚胎的毒性效應大小的影響，結果以平均死亡率、平均孵化率和平均致畸率表示。數(shù)據(jù)采用極差分析法篩選出對斑馬魚胚胎致死毒性、發(fā)育毒性和致畸毒性影響最大的水平組合。極差越大，代表4種PAEs的聯(lián)合作用時該因素對斑馬魚胚胎毒性的影響越大；極差越小，代表4種PAEs的聯(lián)合作用時該因素對斑馬魚胚胎的毒性的影響越小。

2 結 果

2.1 單一毒性試驗

根據(jù)各組48 h死亡率，以概率單位計算LC50值，試驗結果見表2。

對暴露在鄰苯二甲酸酯類溶液里的斑馬魚胚胎進行觀察可以發(fā)現(xiàn)：暴露4 h后觀察，部分胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，原本應該光滑的胚胎細胞表面出現(xiàn)了一些包狀突起(見圖1：d)，且多見于動物極，隨著時間的延長，包狀突起逐漸變大，導致出現(xiàn)細胞自溶現(xiàn)象(見圖1：e、f)。經過一段時間(一般不超過延長期)后導致卵凝結(見圖1：g)。

圖1 PAEs暴露下斑馬魚胚胎不同發(fā)育時期形態(tài)變化圖

暴露8 h后觀察，進入原腸胚期的胚胎細胞有部分出現(xiàn)卵黃囊分裂異常，形成卵黃外突，也會出現(xiàn)胚胎細胞的自溶現(xiàn)象(見圖1：j、k、l)，導致卵凝結。原腸胚期胚層運動的方式是外包，胚胎因外包功能的缺失而妨礙前后體軸的形成，而導致了以上異常的產生[13]。

暴露12 h后觀察，胚胎處于分裂期，肌節(jié)開始形成(見圖1：m)，為器官形成的初級階段，暴露后的胚胎可能會出現(xiàn)尾部畸變和卵黃囊異常(見圖1：o)。

暴露24 h和48 h后觀察，由于這個時期的胚胎處在成形期和孵化期，尾部已經與卵黃囊分離，且色素沉積較多(見圖1：n)，很容易觀察到形體、心臟和血液循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育，可發(fā)現(xiàn)有部分胚胎出現(xiàn)心包腫大、心率緩慢、脊椎和尾部彎曲，色素沉積減少等現(xiàn)象(見圖1：p)。

表2 四種鄰苯二甲酸酯類對斑馬魚胚胎的48 h LC50值

2.2 聯(lián)合毒性試驗

4種鄰苯二甲酸酯混合暴露時對斑馬魚胚胎死亡率、孵化率和致畸率的影響正交試驗結果如表3所示，正交試驗極差分析見圖2。

圖2 4種PAEs混合暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育正交試驗的死亡率、孵化率和致畸率的極差分析

2.2.1 PAEs混合暴露對斑馬魚胚胎致死毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中DEP對斑馬魚胚胎死亡率的影響最大,其次是DMP,最小的是DEHP。但通過正交試驗分析，混合暴露中DBP與DEHP的交互作用對斑馬魚胚胎致死毒性的影響最大。其次為DBP和DEP以及DMP和DEHP的交互作用。當DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.10, 2.50, 0.20和0.80 mg/L的質量濃度混合暴露時對斑馬魚胚胎死亡率的影響最大。

2.2.2 PAEs混合暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中，DEP和DMP對斑馬魚胚胎死亡率的影響較大，DEHP對胚胎死亡率的影響最小。正交試驗分析表明DBP和DEHP的交互作用對斑馬魚胚胎孵化率的影響最大,其次是DEP和DBP交互作用以及DMP與DEHP的交互作用。當DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.10, 2.50, 0.01, 0.40 mg/L的質量濃度混合暴露時對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性影響最大。

2.2.3 PAEs混合暴露對斑馬魚致畸毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中DBP對斑馬魚胚胎孵化率的影響最大,其次是DMP,最小的是DEP。而4種鄰苯二甲酸酯交互作用對胚胎孵化率的影響不大。當DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.90, 5.00, 0.20和 0.40 mg/L的質量濃度混合時對斑馬魚胚胎的致畸毒性影響最大。

3 討 論

根據(jù)48 h半致死質量濃度，4種鄰苯二甲酸酯類化合物對斑馬魚胚胎的毒性大小依次為DBP>DEHP>DEP>>DMP，不同種類PAEs的毒性效應各有不同，這可能這與鄰苯二甲酸酯鏈上的碳鏈長度有關，碳鏈越長相對脂溶性越強，對斑馬魚胚胎的毒性越大。有文獻報道4種鄰苯二甲酸酯類化合物對綠藻Selenastrumcapricornutum的毒性大小為DEHP>DBP>DEP>DMP[14]。Naoki等研究了蝦(Brine Shrimp)卵分別在DMP、DEP和DBP的溶液中孵化，結果表明3種PAEs的毒性大小為DBP>DEP>DMP[15]；與本研究的結果有相似之處。Yang等[16]和Liu等[17]分別對鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)的胚胎進行酞酸酯類化合物毒性試驗，發(fā)現(xiàn)上述4種PAEs的毒性大小依次為DBP>DMP>DEP>DEHP，有研究認為由于DEHP側鏈較長，有較高的脂溶性，使其難于滲透到胚胎細胞中，因此表現(xiàn)出比其它3種PAEs毒性低[18]。高質量濃度(大于或等于半致死質量濃度)的PAEs會造成斑馬魚胚胎在短時間內就凝結死亡；而較高的濃度(在不致死的情況下)會導致胚胎同時出現(xiàn)發(fā)育阻滯、色素沉積減少、心包水腫并伴有心率減慢、脊椎和尾部畸形、卵黃囊異常等毒性指標的4種以上；暴露在較低質量濃度(小于半致死質量濃度)PAEs下的斑馬魚的胚胎只會出現(xiàn)以上毒性指標的一種或同時出現(xiàn)兩種，一般多表現(xiàn)為為脊椎和尾部彎曲。

表3 4種鄰苯二甲酸酯混合暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的正交試驗及其結果1)

1) m1：水平1平均值；m2：水平2平均值；m3：水平3平均值。

在混合暴露中，4種鄰苯二甲酸酯類化合物對斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響相似,影響程度的大小依次為DEP>DMP>DBP>DEHP,結果不同于單一毒性試驗, 這可能是由于混合暴露中各化合物之間存在協(xié)同或者拮抗的效應。

DBP和DEHP在混合暴露中的交互作用對斑馬魚胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性的影響相對較大，二者間可能發(fā)生協(xié)同作用導致毒性加強；同樣DBP和DEP、DMP和DEHP間也會發(fā)生協(xié)同作用。

DMP和DBP交互作用時對斑馬魚胚胎致死毒性的影響與DMP單因素的影響程度是相似，而對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的影響則比DMP單因素的影響都強, 說明二者交互作用時，DMP對斑馬魚胚胎致死毒性的影響起主導作用，但對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性DBP和DMP表現(xiàn)為協(xié)同作用。

DEP對斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響比其它3種鄰苯二甲酸酯的影響要大，當DEP分別和DMP、DEHP、DBP交互時，DEP對聯(lián)合毒性的影響起主導作用，只有當DEP和DBP交互作用時對斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響會加強，表現(xiàn)為協(xié)同作用；而當DEP與DMP交互時，對斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響比二者單因素的影響都要小，說明DEP和DMP之間存在拮抗作用。

當DEHP與其他幾種PAEs交互作用時，往往會使其毒性變大。

4種鄰苯二甲酸酯類化合物聯(lián)合作用對斑馬魚胚胎致畸毒性的影響結果不同于對其致死毒性和發(fā)育毒性的影響。DBP和 DMP在混合暴露中對斑馬魚胚胎致畸毒性的影響都很大，而正交分析表明二者交互時其影響程度降低，DBP和DMP對胚胎致畸毒性表現(xiàn)為拮抗作用； DMP和 DEHP交互作用的情況與 DBP和 DMP交互作用的情況相同，二者之間也出現(xiàn)拮抗作用；相反， DEP和DEHP對斑馬魚胚胎混合暴露致畸毒性的影響相對比較小，但正交分析DEP和DEHP交互作用對胚胎致畸毒性的影響程度顯著升高，說明二者之間存在協(xié)同作用。

在鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中，4種不同的化合物酯對斑馬魚胚胎致死毒性、胚胎發(fā)育毒性和胚胎致畸毒性過程中會表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗不同作用的影響，其確切機理還有待進一步的研究。復合污染物暴露產生的毒性效應較單一的污染物復雜，它們的毒性效應與介質及不同污染物的組合關系、污染物的濃度、暴露的對象和暴露方式等因素密切相關。

4 結 論

1)DMP、DEP、DBP和DEHP對斑馬魚胚胎的48 h LC50值分別為5.06、0.89、0.20和0.77 mg/L，毒性大小依次為DBP、DEHP、DEP、DMP。

2)在所設計的四因素三水平正交試驗的濃度范圍內，4種PAEs混合暴露過程中，DBP和DEHP交互作用對斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性影響最大，而DEHP影響卻是最小。DBP對斑馬魚胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性的影響相對較小，但對斑馬魚胚胎的致畸毒性的影響很大，在混合暴露中DBP就會導致胚胎發(fā)育的嚴重畸形。而DMP和DEHP交互作用的影響最小。

參考文獻：

[1] MARIKO M, MUTSUKO H K, MAKOTO E. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2008,50:37-49.

[2] HUANG Pochin, TIEN Cheinjung, SUN Yihmin, et al. Occurrence of phthalates in sediment and biota: Relationship to aquatic factors and the biota-sediment accumulation factor[J].Chemosphere,2008,73:539-544.

[3] HARRISSON P T C, HOLMES P, HUMIREY C D N. Reproductive health in humans and wildlife: are adverse trend associated with environmental chemical exposure[J].The Science of the Total Environment,1997,205:97-106.

[4] LATINI G. Monitoring phthalate exposure in humans[J].Clinica Chimica Acta,2005,361:20-29.

[5] SCOTTA. Industry slams its own study after it links asthma to phthalates[J].Chemical Week,2004,106(28):13.

[6] 王蕊,李厚勇,王子蘭,等.鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯致畸致突變實驗研究[J].癌變·畸變·突變,2002,14(2):120-121.

[7] 周文敏.環(huán)境優(yōu)先污染物[M].北京:中國環(huán)境科學出版社,1989:11-13.

[8] 金相燦.有機化合物污染化學-有毒有機物污染化學[M].北京:清華大學出版社,1990:266-275.

[9] 李瀟,聶湘平,潘德博,等.養(yǎng)殖魚體鄰苯二甲酸酯含量與分布特征[J].環(huán)境與健康雜志,2008,25(3):202-204.

[10] SCHULTE C, NAGEL R. Test Acute Toxicity in the Embryo of Zebrafish,Brachydanio rerio,as an Alternative to the Acute Fish Test: Preliminary Results[J].Alternatives to Laboratory Animals,1994,22:12-19.

[11] OECD(Organization for Economic Cooperation and Development). OECD TG212 Fish,short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages[S].Paris France:Europe Committee,1998:208-209.

[12] 周宇,于紅霞,丁翔,等.氯代苯類有機污染物對斑馬魚胚胎聯(lián)合毒性效應的研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2003,22(3):340-344.

[13] AXEL O. The Use of a Refined Zebrafish Embryo Bioassay for the Assessment of Aquatic Toxicity[J].Research Note,2000,29(7):32-40.

[14] ADAMS W J, BIDDINGER G. R, ROBILLARD K A. A summary of the acute toxicity of 14 phthalate esters to representative aquatic organism[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1995,14(9):1569-1574.

[15] NAOKI S. Toxic effect of a normal series of phthalate esters on the hatching of shrimp eggs[J].Toxicology and Applied Pharmacology,1974,30(1):87-89.

[16] YANG Zhihui, ZHANG Xiangjing, CAI Zhonghua. Toxic effect of several phthalate esters on the embryos and larvae of abaloneHaliotisdiversicolorsupertexta[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2009,27(2):395-399.

[17] LIU Ying, GUAN Yuntao, YANG Zhihui, et al. Toxicity of seven phthalate esters to embryonic development of the abaloneHaliotisdiversicolorsupertexta[J].Ecotoxicology,2009,18:293-303.

[18] STAPLES C A, ASAMS W J, PARKERTON J W, et al. Aquatic toxicity of eighteen phthalate esters[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1997,16(5):875-891.