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(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

核酸疫苗即DNA疫苗，是將編碼的保護性抗原基因構(gòu)建真核表達質(zhì)粒直接導(dǎo)入動物體細胞內(nèi)，使外源基因通過機體內(nèi)源性表達系統(tǒng)并提呈給免疫系統(tǒng)，誘發(fā)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。由于質(zhì)粒DNA傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細胞的效率比較低，估計提供給細胞的每1000個質(zhì)粒分子只有1個能到達細胞核并被表達，導(dǎo)致徹底治愈疾病需要大量的質(zhì)粒DNA,因此，隨著核酸疫苗進入臨床研究，必須開發(fā)質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。

質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的工藝流程包括質(zhì)粒DNA的構(gòu)建、工程菌發(fā)酵、菌體收集、細菌裂解、純化濃縮、質(zhì)量檢驗與包裝等，其中重組工程菌的發(fā)酵和質(zhì)粒DNA的純化是影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)階段對發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的研究方向主要集中在培養(yǎng)基的設(shè)計和培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，例如，O′Kennedy等[1，2]研究了培養(yǎng)基對質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，同時就不同發(fā)酵策略對質(zhì)粒產(chǎn)量的影響進行了研究。但是，如以這些研究結(jié)果作為本發(fā)酵過程的操作依據(jù)，并不能解決由不同質(zhì)粒、不同菌種造成的過程特殊性問題。為此，作者針對含有質(zhì)粒pVAXON-hCGβ的大腸桿菌DH5α系統(tǒng)，采用搖瓶實驗考察了碳源、C/N比對質(zhì)粒DNA含量的影響，并從代謝途徑方面考察了糖酵解途徑抑制劑對質(zhì)粒DNA含量的影響,初步確立了腫瘤核酸疫苗的大腸桿菌發(fā)酵的優(yōu)化營養(yǎng)條件。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α菌株由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。質(zhì)粒為在pVAX-1的基礎(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒pVAXON-hCGβ，攜帶有ON33寡核苷酸，大小為3.7 kb，具有硫酸卡那霉素抗性。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1， NaCl 10 g·L-1，瓊脂粉2%(質(zhì)量比)。

PDM培養(yǎng)基：胰蛋白胨7.93 g·L-1，酵母浸出粉4.41 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 17.096 g·L-1，KH2PO43.00 g·L-1，NH4Cl 0.5 g·L-1，MgSO40.24 g·L-1。

改良的PDM培養(yǎng)基：胰蛋白胨7.93 g·L-1，酵母浸出粉4.41 g·L-1，甘油10 g·L-1，Na2HPO4·7H2O 20.5152 g·L-1，KH2PO43.6 g·L-1，NH4Cl 2.68 g·L-1，MgSO40.24 g·L-1。使用時加入50 μg·mL-1硫酸卡那霉素。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取-80℃保存的甘油管菌種涂板于含50 μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接入50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)10 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液以1%(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基及50 μg·mL-1硫酸卡那霉素)，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)10 h。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞密度測定

菌體濃度稀釋至OD600=0.1～0.6(d=1 cm)，用分光光度計在600 nm處測細胞密度。

1.3.2 菌體干重(DCW)測量

用預(yù)先稱重的離心管取一定體積發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用去離子水重新懸浮細胞，10 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，于110℃的烘箱內(nèi)烘干，經(jīng)3次稱重，恒重后得到菌體干重。

1.3.3 質(zhì)粒產(chǎn)量的測定

稱取一定量離心后的濕菌體，用Omega公司提供的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，吸取800 μL經(jīng)試劑盒抽提得到的質(zhì)粒DNA溶液，加水3 mL，轉(zhuǎn)入石英比色皿中測A260和A280，以A260乘以50得出純化后質(zhì)粒DNA的含量( mg·L-1)，質(zhì)?？截悢?shù)由單位菌體質(zhì)粒含量(mg質(zhì)粒/g菌體干重，記為mg·g-1)衡量[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

碳源對菌體生長和產(chǎn)物形成非常重要，由于菌種所含的酶系統(tǒng)不完全一樣，各類菌種對不同碳源的利用速率和效率也不一樣，同時不同碳源發(fā)酵的同一菌體得率和產(chǎn)物收率也不同，所以選擇合適的碳源非常重要。在PDM培養(yǎng)基中用不同碳源做對比實驗，其添加量為10 g·L-1，考察碳源對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源對質(zhì)粒DNA產(chǎn)量和菌量的影響

由圖1可知,用乳糖和蔗糖作碳源時，菌量和質(zhì)粒DNA含量較低，用葡萄糖作碳源時，質(zhì)粒DNA含量遠遠低于用甘油作碳源，這是由于過多的葡萄糖會過分加速菌體的呼吸，大大降低培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧，使得一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基內(nèi)，如乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)，從而嚴重地影響了質(zhì)粒的復(fù)制，而用甘油作碳源時，其在一定程度上能夠避免一些中間代謝物的阻礙作用和抑制性有機酸的積累，因此，雖然菌量不是最高，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻最高，表明甘油是大腸桿菌產(chǎn)pVAXON-hCGβ質(zhì)粒的最佳碳源。

2.2 初始甘油濃度對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

將大腸桿菌DH5α菌株培養(yǎng)在以甘油為唯一碳源的改良PDM培養(yǎng)基中，考察初始甘油濃度對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 初始甘油濃度對菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由表1可知，隨著初始甘油濃度的增加，菌量變化不大，但質(zhì)粒含量卻有較大差別，初始甘油濃度為2 g·L-1時，質(zhì)粒含量較高，隨著初始甘油濃度的進一步提高，質(zhì)粒含量下降，隨后繼續(xù)上升，當初始甘油濃度為10 g·L-1時，菌量只有2.23 g·L-1，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻達到最高，分別為9.54 mg·L-1和4.29 mg·g-1。

2.3 C/N比對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

改變PDM培養(yǎng)基中NH4Cl濃度，使碳氮比(C/N)在4.39～6.84之間變化，考察C/N比對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 C/N比對菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖2可知，菌量、質(zhì)粒DNA含量和單位菌體質(zhì)粒含量受C/N比影響較大，質(zhì)粒含量在C/N比為5.24時可達6.068 mg·L-1。C/N比對質(zhì)粒DNA含量影響較大的原因仍不是很清楚，但Bryers等[4]認為大腸桿菌中質(zhì)粒的丟失率與C/N比有很大的關(guān)系，當大腸桿菌在較高的C/N比中生長時，代謝的葡萄糖大部分被用于胞外聚合物的生產(chǎn)，這有可能使細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)受到影響，從而使質(zhì)粒的產(chǎn)量減少。

2.4 檸檬酸鈉濃度對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度(0～9 g·L-1)的檸檬酸鈉，考察其對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 檸檬酸鈉濃度對菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖3可知，添加檸檬酸鈉后菌量下降，隨其濃度的不斷增加，菌體生長受到嚴重抑制，當檸檬酸鈉添加量小于3 g·L-1時，質(zhì)粒DNA含量不斷提高，添加量為3 g·L-1時質(zhì)粒DNA含量最高為11.73 mg·L-1，提高了20%。這是因為檸檬酸、ATP是磷酸果糖激酶(PFK)的變構(gòu)抑制劑，胞內(nèi)檸檬酸可通過加強ATP的抑制效應(yīng)來抑制磷酸果糖激酶的活力，檸檬酸鈉的添加降低了PFK的活力，而PFK又是影響EMP途徑通量的關(guān)鍵酶，其活力降低則糖酵解過程減慢。另外，檸檬酸可以增加鈣離子的吸收，而鈣離子是丙酮酸激酶(PK)的強烈抑制劑，因此檸檬酸鈉的添加導(dǎo)致了糖酵解途徑中關(guān)鍵酶PFK和PK活力的降低，從而引起糖酵解過程酶反應(yīng)速率減慢，通量減少，進而導(dǎo)致HMP途徑代謝通量的增加，為核酸的生物合成提供更多的前體。

2.5 氟化鈉濃度對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

在菌體生長8 h后向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度的氟化鈉，考察其對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氟化鈉濃度對菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖4可知，添加氟化鈉后菌量有所下降，但質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量卻隨氟化鈉濃度的增大而增大，當添加氟化鈉濃度為120 mg·L-1時，質(zhì)粒含量和單位菌體質(zhì)粒含量最高為12.09 mg·L-1和4.851 mg·g-1，質(zhì)粒含量比未添加氟化鈉時提高了29%。當濃度超過120 mg·L-1后，質(zhì)粒含量開始下降。這可能是因為氟化鈉是糖酵解抑制劑，可以降低糖酵解途徑中丙酮酸激酶的酶活力[5]，從而有效地減少了糖酵解途徑的代謝流，可使更多的糖類轉(zhuǎn)向HMP途徑，為核苷酸和核酸的生物合成提供更多的前體。

2.6 乙醇濃度對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響

向改良的PDM培養(yǎng)基中添加不同濃度的乙醇，考察其對細胞生長和質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對菌量和質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的影響

由圖5可知，加入不同濃度的乙醇后菌量均下降，當乙醇添加量為2 g·L-1時，質(zhì)粒含量最高為12.94 mg·L-1，比未添加時提高了32%，隨乙醇濃度的進一步增大，質(zhì)粒DNA含量下降。一般認為培養(yǎng)基組成對細胞生長速率有影響，并進而影響質(zhì)?？截悢?shù)。細胞分裂過快，質(zhì)粒復(fù)制速率趕不上細胞分裂速率，容易造成質(zhì)粒丟失，細胞的比生長速率越快，質(zhì)粒拷貝數(shù)越低。加入乙醇后，由于其能夠降低水活度和乙醇本身的毒性，對菌體生長產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致生長速率的減緩，質(zhì)粒拷貝數(shù)提高。而高濃度的乙醇毒性增加，對維持細胞、酶與膜的功能與結(jié)構(gòu)不利，導(dǎo)致菌量和質(zhì)?？截悢?shù)下降。另外，Stouthamer[6]發(fā)現(xiàn)，合成1 g(34.7 mmol)不含質(zhì)粒的細胞所需的能量大部分被用于蛋白合成，只有3.2%的能量用于DNA合成，而含有質(zhì)粒的細胞中帶有卡那霉素抗性基因，由于這些細胞中卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成致使ATP需求增加了24%[7]，因此卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成可能是質(zhì)粒DNA復(fù)制的一個瓶頸，而乙醇在代謝過程中被氧化成乙酸，并釋放能量，產(chǎn)生ATP，因此乙醇的加入可能同時還起到了能源的作用。

3 結(jié)論

(1)甘油是質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的最佳碳源；C/N比對質(zhì)粒DNA含量影響明顯。向改良的PDM培養(yǎng)基中添加3 g·L-1的檸檬酸鈉，可以降低糖酵解途徑的代謝通量，使質(zhì)粒含量達到11.73 mg·L-1, 提高了20%。

(2)氟化鈉是糖酵解途徑的抑制劑，在菌體生長8 h后，向改良的PDM培養(yǎng)基中添加濃度為120 mg·L-1的氟化鈉，培養(yǎng)后質(zhì)粒DNA含量為12.09 mg·L-1,提高了29%。氟化鈉是具有一定毒性的物質(zhì)，在合適的時間添加適量的氟化鈉才會在基本不影響菌體正常代謝的條件下提高質(zhì)粒DNA的含量。本實驗未深入研究氟化鈉對菌體的負面影響。

(3)在改良的PDM培養(yǎng)基中添加2 g·L-1的乙醇，可使質(zhì)粒DNA含量達到12.94 mg·L-1，比未添加時提高了32%。乙醇提高質(zhì)粒DNA含量的作用機制尚需進一步深入研究，且乙醇易燃，存在安全隱患問題。

參考文獻：

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[2] O′Kennedy R D, Ward J M， Moore E K. Effects of growth medium selection on plasmid DNA production and initial processing steps[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 76:175-183.

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[4] Bryers J D, Huang C T. Recombinant plasmid retention and expression in bacterial biofilm cultures[J]. Water Sci Technol， 1995, 31(1):105-115.

[5] Guminska M, Sterkowicz J. Effect of sodium fluoride glycolysis in human erythrocytes and Ehrlich tumor cellsinvitro[J]. Acta Biochim Pol， 1976, 23(4):285-291.

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[7] Rozkov A, Avignone-Rossa C A, Ertl P F. Characterization of the metabolic burden onEscherichiacoliDH1 cells imposed by the presence of a plasmid containing a gene therapy sequence[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 88(7):909-915.