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(東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 南京 210009)

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，約占植物干重的30%～50%，是自然界中分布最廣的天然高分子化合物，也是地球上數(shù)量最豐富、最廉價(jià)的可再生資源[1,2]。自然界中廣泛存在產(chǎn)纖維素酶的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等。微生物產(chǎn)生的纖維素酶已經(jīng)用于纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)葡萄糖、飼料工業(yè)、紡織行業(yè)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)產(chǎn)品加工等方面[3]。直接從環(huán)境中選育出來(lái)的野生型菌株產(chǎn)纖維素酶活性不高，菌種易退化，限制了其應(yīng)用范圍。因此，選育高產(chǎn)纖維素酶活性的微生物類群是人們研究的熱點(diǎn)之一。作者從朽木、腐爛的竹葉和稻草中分離得到8株纖維素分解菌，并對(duì)其中酶活較高的菌株進(jìn)行了紫外線誘變。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

朽木、腐爛的竹葉與稻草從自然界中采集。

DNS試劑，pH值7.2的緩沖溶液，1%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)磷酸緩沖溶液。

1.2 培養(yǎng)基

霉菌斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g, 蔗糖20 g, 瓊脂17 g, 蒸餾水1000 mL, pH值自然。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基:(NH4)2SO42 g, MgSO40.5 g, KH2PO41 g, NaCl 0.5 g, 羧甲基纖維素鈉10 g, 瓊脂17 g, 蒸餾水1000 mL, pH值自然。

產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基: 麥草粉40 g, 麥麩10 g,(NH4)2SO41.5 g, KH2PO41.0 g, MgSO40.5 g, NaCl 0.2 g, CaCl20.2 g, 蒸餾水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與初篩

朽木、腐爛的竹葉與稻草等分別放入錐形瓶中，加入適量的滅菌生理鹽水，振蕩30 min，靜置，各吸取上清液1 mL，分別稀釋10、102、103倍，涂布在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d，挑取大的單菌落進(jìn)行劃線分離。將分離得到的菌株接種于新的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用剛果紅染色法[3]測(cè)定菌落直徑及透明圈直徑，對(duì)其中8株產(chǎn)酶活性較高的菌株進(jìn)行酶活性測(cè)定，從中篩選出產(chǎn)酶活性最高的菌株。

1.3.2 2#菌株孢子懸液制備

將初篩得到的2#菌株接種到霉菌斜面培養(yǎng)基上活化3 d，用無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，打散后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋孢子液濃度至1×106～1×108個(gè)·mL-1，得孢子懸液。

1.3.3 紫外線誘變處理

打開紫外燈將無(wú)菌操作箱滅菌20 min。取 8 個(gè)直徑9 cm培養(yǎng)皿，每皿中加入5 mL孢子懸液，在20 W紫外燈下30 cm處分別照射0 s、6 s、12 s、18 s、24 s、30 s、40 s、50 s，將經(jīng)過(guò)照射的孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，黑布包好后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。菌落計(jì)數(shù)，繪制存活曲線。

1.3.4 突變株的篩選

選擇致死率為60%～90%的紫外線劑量誘變。將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，按初篩方法篩選出產(chǎn)酶活性較高的突變株。將其接入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3 d。用DNS比色法測(cè)定酶活性，進(jìn)一步篩選出產(chǎn)酶活性較高的突變株，接種于斜面上，置于冷藏室保存。

1.3.5 纖維素分解菌的酶活性測(cè)定[4，5]

將菌株接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液在3500 r·min-1離心10 min，上清液即為初酶液。移取含有1% CMCNa的磷酸緩沖溶液1.5 mL于試管中，加人初酶液0.5 mL，于50℃水浴中保溫20 min后，按DNS法測(cè)糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用DNS法[4]，在波長(zhǎng)為530 nm條件下，測(cè)定一系列已知濃度葡萄糖的OD值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 菌株的初篩

涂布了樣品水溶液的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出很多大小不同的菌株，菌株顏色有乳白色、淺綠色、墨綠色、灰白色、黑色等。觀察菌株形態(tài)，大部分為霉菌。用剛果紅染色法選取8株透明圈直徑(D2)和菌落直徑(D1)的比值相對(duì)較大的菌株，結(jié)果見表1。

表1 8株菌株的透明圈直徑和菌落直徑

測(cè)定上述8株菌株的酶活性，結(jié)果見表2。

表2 8株菌株酶活性測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出，2#、6#和8#菌的OD值及產(chǎn)酶活性較高，尤其是2#，這與剛果紅染色法結(jié)果一致。但對(duì)于3#、4#、7#菌，剛果紅染色法與OD法測(cè)定的酶活性大小不同。所以僅以D2/D1值作為菌株產(chǎn)纖維素酶活性大小的唯一定量指標(biāo)不可靠。因?yàn)椴煌N、生長(zhǎng)條件、纖維素酶系、產(chǎn)酶速度、菌苔大小及在平板上堆積情況的差異都可能造成D2/D1值與產(chǎn)酶活性結(jié)果的不完全一致[6]。綜合兩種方法結(jié)果，選擇2#菌株進(jìn)行紫外線誘變。

2.3 2#菌株紫外誘變存活率曲線(圖2)

圖2 存活率與紫外線照射時(shí)間的關(guān)系

從圖2可以看出，在0～50 s照射時(shí)間內(nèi)，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，2#菌存活率迅速下降。照射時(shí)間為5 s、6 s、12 s、19 s時(shí)其致死率分別為60%、70%、80%、90%。

2.4 突變株的篩選

以致死率60%～90%的紫外線劑量誘變2#菌株，得到了一系列突變株，結(jié)果見表3。

表3 致死率為60%～90%的突變株篩選情況

從表3可以看出，致死率為80%的M10菌株在所有突變株中產(chǎn)酶活性最大，其產(chǎn)酶活性相對(duì)于出發(fā)菌株提高了89.1%。

3 結(jié)論

(1)利用羧甲基纖維素鈉為唯一碳源培養(yǎng)基從朽木、腐爛的竹葉與稻草中分離得到8株纖維素分解菌，測(cè)定了其產(chǎn)酶活性。對(duì)其中產(chǎn)酶活性較高的2#菌株進(jìn)行紫外線誘變，進(jìn)一步篩選得到突變株M10，相對(duì)酶活較出發(fā)菌株提高了89.1%。

(2)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以水解圈直徑/菌落直徑比值判斷菌株產(chǎn)纖維素酶活性大小并不可靠，需要進(jìn)一步測(cè)定酶活。

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