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(貴州大學(xué)生化營養(yǎng)研究所，貴州 貴陽 550025)

追風(fēng)傘(LysimachiaparidiformisFranch.var.Stenophylla Franch.)系報春花科植物狹葉落地梅的全草或根，主要分布于湖南、四川、貴州等地。追風(fēng)傘多以全草入藥，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛等功效，具有較高的藥用價值[1,2]，其中黃酮類成分含量豐富[3]。

大孔吸附樹脂是一種人工合成的具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，性能優(yōu)良，已在醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是可用于純化中藥的有效成分[4，5]。研究表明，大孔吸附樹脂用于黃酮類化合物的提取分離、精制純化效果較好[6～8]，但目前尚未見將其用于追風(fēng)傘中總黃酮的分離純化。作者在此采用大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮進行分離純化，優(yōu)化了工藝條件，擬為追風(fēng)傘資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

追風(fēng)傘全草購于貴州省貴陽市花果園藥材市場。

蘆丁對照品(批號0080-9705)，中國藥品生物制品檢定所；D101、H103、D4020、NKA-9、S-8、X-5、AB-8型大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)化工廠；其它試劑均為分析純。

TU-1901型紫外分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；1004型電子分析天平，上海天平儀器廠；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博達實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 樣品制備及測定方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取追風(fēng)傘干品粗粉100 g，依次加入12 BV、10 BV、8 BV的50%乙醇，加熱回流提取，每次3 h，合并提取液，濾過。濾液減壓回收乙醇至無醇味。濃縮液加水稀釋，靜置，抽濾除去不溶性物質(zhì)，濾液再次濃縮，即得追風(fēng)傘供試品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品23.50 mg，置100 mL容量瓶中，加入適量60%乙醇溶液超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，得標準溶液。精密量取標準溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加60%乙醇至6 mL；各加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；各加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；各加4% NaOH溶液10 mL；最后各加60%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min，用紫外分光光度儀在500 nm波長處測定吸光度。以吸光度值(A)對濃度(c)繪制標準曲線，擬合線性回歸方程為：A=0.01076c+0.0019，R=0.9999，線性范圍為0～56.4 μg·mL-1。

1.2.3 樣品的測定

取一定量待測供試品溶液于25 mL容量瓶中，按1.2.2方法測定吸光度，計算供試液中總黃酮的含量。

1.3 大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的靜態(tài)吸附實驗

1.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

用95%乙醇浸泡樹脂24 h，使其充分溶脹，除去上浮樹脂碎片和雜物，濕法裝柱，用95%乙醇以適當(dāng)流速通過樹脂柱，洗至流出液與蒸餾水(1∶5)混合無白色混濁現(xiàn)象，然后用大量蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量測定

精確稱取1.0 g預(yù)處理好的大孔吸附樹脂于具塞磨口錐形瓶中，加入總黃酮濃度為1.860 mg·mL-1的追風(fēng)傘供試液50 mL，于室溫下150 r·min-1振蕩24 h，充分吸附后，過濾并測定濾液中總黃酮濃度，按式(1)、式(2)分別計算各樹脂的靜態(tài)吸附量(Q，mg·g-1)和吸附率(E)。

(1)

(2)

式中：c0為初始濃度，mg·mL-1；ce為平衡濃度,mg·mL-1；V1為原溶液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

1.3.3 大孔吸附樹脂的解吸率測定

將吸附飽和的樹脂濾出，吸干表面水分，加入80%(體積分數(shù))乙醇溶液50 mL，于室溫下150 r·min-1振蕩24 h，充分解析后，過濾并測定濾液中總黃酮濃度，按式(3)、式(4)分別計算解吸率(D)與回收率(P)。

(3)

(4)

式中:cx為解吸溶液濃度,mg·mL-1；V2為解吸溶液體積，mL。

1.4 大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的動態(tài)吸附實驗

1.4.1 動態(tài)吸附曲線的繪制以及動態(tài)飽和吸附量的測定

將一定濃度的追風(fēng)傘供試液通過裝有10.0 g已預(yù)處理大孔吸附樹脂的層析柱，分段收集流出液，每10 mL收集1份，共收集36份，測定每段收集液中總黃酮的濃度，當(dāng)流出液中總黃酮濃度(c)與初始樣品液中總黃酮濃度(c0)基本趨于一致時停止上樣，以c/c0對收集時間(t)繪制動態(tài)吸附曲線。

用少量蒸餾水沖洗層析柱，使樹脂床中的上樣液完全流出，合并流出液，測定流出液體積以及總黃酮的濃度。然后靜置20 min，再用大量蒸餾水沖洗樹脂，直至流出的水洗液接近無色，收集水洗液，測定水洗液體積和總黃酮的濃度。計算樹脂動態(tài)飽和吸附量。

動態(tài)飽和吸附量=(上樣液中總黃酮濃度×上樣液體積-流出液中總黃酮濃度×流出液體積-水洗液中總黃酮濃度×水洗液體積)/濕樹脂質(zhì)量

1.4.2 動態(tài)吸附和動態(tài)解吸實驗

稱取10.0 g已預(yù)處理的樹脂，濕法裝柱。將一定濃度的追風(fēng)傘供試液通過樹脂柱，測定流出液中總黃酮的濃度，以總黃酮吸附量、回收率為指標考察上樣液的濃度及流速等因素對樹脂吸附性能的影響；將一定體積分數(shù)的乙醇通過裝有已吸附樣品的樹脂柱，測定不同洗脫條件下洗脫液中總黃酮的濃度，以總黃酮回收率、解吸率為指標考察洗脫劑體積分數(shù)及其用量等因素對樹脂解吸性能的影響，從而篩選出樹脂動態(tài)吸附和解吸的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

選擇7種不同表面性質(zhì)(樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu))的樹脂對樣品溶液進行吸附處理，測其靜態(tài)吸附量和解吸率，結(jié)果見表1。

表1 不同大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸率

由表1可知， 7種樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的吸附容量以及解吸性能存在差異。其中，S-8型樹脂易吸附，但解吸率太低，不適用于分離；D101型樹脂有較大的靜態(tài)吸附量，同時也較容易解吸附，表現(xiàn)出較好的綜合吸附純化能力。綜合分析，選擇D101型大孔吸附樹脂進行動態(tài)吸附實驗。

2.2 D101型大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附結(jié)果

2.2.1 動態(tài)吸附曲線(圖1)

圖1 D101型大孔吸附樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附曲線

由圖1可見，當(dāng)吸附時間達到150 min(即收集液體積達到300 mL)左右時，D101型大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的吸附已經(jīng)基本趨向飽和。

2.2.2 動態(tài)飽和吸附量

實驗中，上樣液濃度為3.286 mg·g-1時，流出液和水洗液中的總黃酮量為186 mg，D101型大孔吸附樹脂的動態(tài)飽和吸附量為80.05 mg·g-1，與其靜態(tài)吸附量存在一定的差異，有待進一步研究。

2.2.3 上樣液濃度的確定

取已預(yù)處理的D101型大孔吸附樹脂10.0 g，濕法裝柱，將不同濃度的追風(fēng)傘提取液，以不同體積、相同流速上樣。測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計算吸附量。適量水洗后，用70%乙醇洗脫完全，分別收集洗脫液測定總黃酮濃度，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 上樣液濃度對總黃酮吸附量和回收率的影響

由表2可知，當(dāng)上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1時，D101型大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮吸附量最大，回收率也最高。因此，選擇適宜的上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1。

2.2.4 上樣流速的確定

將追風(fēng)傘提取液通過D101型大孔吸附樹脂柱，以相同體積、不同流速進行動態(tài)吸附，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計算吸附量。適量水洗后，用70%乙醇洗脫完全，收集洗脫液測定吸光度，考察不同上樣流速下樹脂的吸附效果和產(chǎn)品的回收率，結(jié)果見表3。

表3 上樣流速對總黃酮吸附量和回收率的影響

由表3可知，上樣流速越大，樹脂泄漏越早，其吸附量相應(yīng)下降。原因可能是在吸附動態(tài)平衡過程中，相同的吸附速度下加快流速，則吸附時間相對縮短，從而影響了樹脂的吸附效果；而放緩上樣流速，固然可提高其吸附量，但卻延長了達到飽和吸附所需時間，也會影響工作效率。綜合考慮，選擇上樣流速為2.0 mL·min-1左右較為合適。

2.2.5 洗脫劑體積分數(shù)的確定

將追風(fēng)傘提取液通過D101型大孔吸附樹脂柱，以相同流速進行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至洗脫液近無色，再分別用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，回收乙醇，蒸干，定容于100 mL容量瓶后測定吸光度，計算解吸率、回收率以及總黃酮純度，結(jié)果見表4。

表4 洗脫劑體積分數(shù)對總黃酮解吸率、回收率及純度的影響

由表4可知，90%乙醇洗脫產(chǎn)物的解吸率與回收率最高，70%乙醇次之；但是70%乙醇洗脫產(chǎn)物總黃酮純度最高，且回收率、解吸率與90%乙醇相近。從節(jié)約成本角度考慮，選擇70%乙醇液為洗脫劑。

2.2.6 洗脫曲線

按上述確定的吸附和洗脫條件，取追風(fēng)傘供試品溶液上柱，然后洗脫，分段收集洗脫液。每10 mL收集1份，共收集20份，分別檢測洗脫液中追風(fēng)傘總黃酮濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 D101型大孔吸附樹脂對總黃酮的動態(tài)洗脫曲線

由圖2可見，當(dāng)洗脫液體積為180～200 mL時，總黃酮濃度相當(dāng)，即洗脫液體積為180 mL時，總黃酮已接近洗脫完全。洗脫劑用量過多會增加洗脫時間，延長生產(chǎn)周期，同時也造成浪費，故確定洗脫劑用量以6 BV(以樹脂柱體積計)為宜。

2.2.7 動態(tài)吸附洗脫驗證

取適量追風(fēng)傘供試液在優(yōu)選的工藝條件下分離純化追風(fēng)傘總黃酮。收集所需成分，測定其濃度后干燥，稱重，得棕黃色粉末。然后精密稱取100 mg精提物粉末(過大孔吸附樹脂純化后的總黃酮粉末)和粗提物粉末(直接濃縮提取液干燥得到)各1份， 分別用60%乙醇使其溶解后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，平行取3份測定總黃酮濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大孔吸附樹脂純化得到的精提物中追風(fēng)傘總黃酮的純度可達86.2%，約為粗提物純度(20.65%)的4倍，且回收率超過90%。

3 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附實驗比較了7種不同類型大孔吸附樹脂的吸附特性，綜合考察吸附能力與解吸性能，篩選出D101型大孔吸附樹脂用于追風(fēng)傘總黃酮的純化富集。通過動態(tài)吸附實驗，確定D101型大孔吸附樹脂吸附純化追風(fēng)傘總黃酮的最佳工藝為：上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1，上樣流速為2.0 mL·min-1；洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為6 BV。D101型大孔吸附樹脂吸附追風(fēng)傘總黃酮的動態(tài)飽和吸附量為80.05 mg·g-1，純化的追風(fēng)傘總黃酮純度達到86.2%，約為純化前的4倍，且回收率超過90%。D101型大孔吸附樹脂適于追風(fēng)傘總黃酮的吸附純化。

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