在高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌以高表達(dá)PNPase的工藝中,氮源對發(fā)酵有著重要的影響。有機(jī)氮源中存在著非常豐富的氨基酸。目前,國內(nèi)外已有很多報道各種氨基酸對重組大腸桿菌高效表達(dá)目的蛋白的影響。作者在此采用單因素方差分析和粗糙集分析,考察了氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)PNPase的影響。
E.coliBL21/pET28a-PNP,卡那霉素抗性,PNP來源于產(chǎn)氣腸桿菌,自行構(gòu)建。
種子培養(yǎng)基(LB):蛋白胨10 g·L-1,酵母粉5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1。
M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基:Na2HPO4·12H2O 12.8 g·L-1,KH2PO43 g·L-1,NaCl 0.5 g·L-1,NH4Cl 1 g·L-1,MgSO40.002 mol·L-1,葡萄糖0.5%,CaCl20.0001 mol·L-1。
合成培養(yǎng)基:M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基+不同濃度的各種游離氨基酸。
復(fù)合培養(yǎng)基:Na2HPO4·12H2O 14.26 g·L-1,KH2PO42 g·L-1,NaCl 7 g·L-1,蛋白胨12 g·L-1,酵母粉 6 g·L-1,MgSO4·7H2O 1 g·L-1,CaCl20.05 g·L-1,甘油 15 g·L-1。
以上培養(yǎng)基在接種前加入終濃度為30 μg·L-1的卡那霉素。
種子培養(yǎng):從斜面上切適當(dāng)大小的菌體瓊脂塊接種到已經(jīng)加入卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):以5%的接種量于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后,加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)3 h,發(fā)酵結(jié)束,得發(fā)酵液。
1.4.1OD600的測定
將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù),用752-C型分光光度計在600 nm測其光吸收值。
1.4.2 PNPase酶活的測定
取20 μL濃度為100 g·L-1的菌液,放入200 μL含3 μmol肌苷的磷酸鈉緩沖溶液中,于37℃、 pH值7.0條件下反應(yīng)1 h,100℃煮沸5 min使酶滅活,13 000 r·min-1離心2 min,取上清稀釋10倍,用高效液相色譜測定次黃嘌呤的含量[3]。高效液相色譜條件為:流動相10%甲醇,C18柱,柱溫40℃,檢測波長254 nm。以每毫升發(fā)酵液每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1 μmol次黃嘌呤的量為1個酶活力單位(U)。
用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
2.1.1 合成培養(yǎng)基中氨基酸濃度的確定
微生物的氮的同化代謝中,轉(zhuǎn)氨的供體來自谷氨酸(Glu)與谷氨酰胺(Gln)[4],所以在合成培養(yǎng)基中采用谷氨酰胺來確定氨基酸添加的濃度。添加不同濃度谷氨酰胺,得到的PNPase總酶活見表1。
表1 添加不同濃度Gln的總酶活
由表1可知,隨著Gln濃度的增加,總酶活相應(yīng)上升。當(dāng)Gln濃度為0.2 g·L-1時,總酶活為20.3 U·mL-1。由于此酶活升高與降低均有較大空間,故采用0.2 g·L-1作為各種氨基酸添加的最終濃度。
2.1.2 合成培養(yǎng)基中各種氨基酸對總酶活的影響[5]
在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)分別添加終濃度為0.2 g·L-1的14種氨基酸,重復(fù)3次,空白對照不添加氨基酸,各氨基酸對應(yīng)的總酶活如表2所示。
表2 合成培養(yǎng)基中不同氨基酸對應(yīng)的總酶活/U·mL-1
采用SPSS 11.5軟件對表2中各氨基酸的濃度進(jìn)行聚類分析,然后將聚類后的結(jié)果與各氨基酸對應(yīng)的總酶活進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),結(jié)果見表3。
表3 單因素方差分析結(jié)果
由表3可知,PTrp=0.016、PGlu=0.036、PAla=0.015、PGln=0.010,均小于0.05,故在合成培養(yǎng)基中,Trp、Glu、Ala、Gln可能在重組大腸桿菌高密度高表達(dá)PNPase的過程中起關(guān)鍵性作用,Glu與Gln是微生物的氮的同化代謝中轉(zhuǎn)氨的供體;Ala分解代謝途徑較為廣泛;Trp在分解代謝中能夠生成非常豐富的碳架復(fù)合物[6],所以添加這幾種氨基酸可能對于高效表達(dá)PNPase起著很重要的作用。
2.2.1 復(fù)合培養(yǎng)基中氨基酸濃度的確定及對總酶活的影響
固定總氮含量,設(shè)計了14種不同氨基酸含量的有機(jī)氮源培養(yǎng)基。采用凱氏定氮法測定不同廠家生產(chǎn)的蛋白胨、酵母粉的總氮含量,采用日立氨基酸自動分析儀測定各原料中各種氨基酸的濃度。由于采用酸水解法水解樣本,因此最終不能檢測出樣本中Gln的濃度。除Gln外,復(fù)合培養(yǎng)基中其余13種氨基酸的濃度及其所對應(yīng)的總酶活如表4所示。
表4 復(fù)合培養(yǎng)基中不同氨基酸濃度及對應(yīng)的總酶活
2.2.2 氨基酸聚類分析及粗糙集分析
運用SPSS 11.5軟件中的K-Means聚類分析法對表4數(shù)據(jù)按照數(shù)值大小進(jìn)行分類,結(jié)果如表5所示。
表5 各氨基酸及對應(yīng)總酶活的聚類分析結(jié)果
由表5可知,粗糙集分析[7]得到Gly和Ala為核屬性,即在復(fù)合培養(yǎng)基中,這兩種氨基酸可能在大腸桿菌產(chǎn)PNPase的發(fā)酵過程中起著關(guān)鍵作用。
2.2.3 Gly和Ala對總酶活的影響
復(fù)配一種Gly和Ala含量相對都較低而其它氨基酸含量相對較高的復(fù)合氮源,然后分別添加不同濃度的Gly或Ala來確證兩種氨基酸對總酶活的影響,結(jié)果如表6所示。
表6 添加不同濃度的Gly或Ala的總酶活/U·mL-1
從表6可以看出,Gly和Ala均對酶活有促進(jìn)作用。當(dāng)Gly濃度在80~140 mg·L-1時的總酶活較高,而Ala濃度為140~200 mg·L-1時的總酶活較高。因此同時添加兩種氨基酸,兩者的終濃度均為140 mg·L-1,對應(yīng)總酶活為28 U·mL-1,比單獨添加兩種氨基酸的總酶活均有明顯提高,說明Gly和Ala對酶活的影響存在交互作用。
根據(jù)實驗結(jié)果,設(shè)計了一種各種氨基酸含量均較低的復(fù)合培養(yǎng)基,通過單獨添加Trp、Ala、Glu、Gln、Gly(終濃度均為0.2 g·L-1)或同時添加Ala、Gly(終濃度均為0.14 g·L-1),考察氨基酸對總酶活的影響,結(jié)果如圖1所示。
圖1 添加各種氨基酸與對照組的總酶活
從圖1可以看出,和對照組相比,在復(fù)合培養(yǎng)基中單獨添加Glu、Trp,總酶活沒有提高;單獨添加Gln、Ala、Gly,總酶活略有提高;共同添加Ala和Gly能明顯提高總酶活。由此說明Ala和Gly能夠共同促進(jìn)PNPase在大腸桿菌BL21內(nèi)大量表達(dá),在PNPase的發(fā)酵生產(chǎn)中起著關(guān)鍵性作用。這可能是由于產(chǎn)氣腸桿菌中PNPase的氨基酸序列中Ala和Gly的含量較高[8],在各種氨基酸都有一定含量的復(fù)合培養(yǎng)基中, 添加Ala和Gly能夠促進(jìn)PNPase的高效表達(dá)。同時也反映單因素方差分析得到合成培養(yǎng)基中的關(guān)鍵性氨基酸不能成為復(fù)合培養(yǎng)基中重組大腸桿菌高密度高表達(dá)PNPase的關(guān)鍵性氨基酸,但合成培養(yǎng)基的單獨添加氨基酸的實驗方法可能適合于PNPase的高效表達(dá)的機(jī)制研究。
采用單因素方差分析,考察了合成培養(yǎng)基中各種氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶總酶活的影響;同時采用聚類分析和粗糙集分析,考察了復(fù)合培養(yǎng)基中氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶總酶活的影響。結(jié)果表明,在合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基中對總酶活影響顯著的是不同的氨基酸。在復(fù)合培養(yǎng)基中,丙氨酸和甘氨酸對產(chǎn)酶有明顯促進(jìn)作用且存在交互作用,兩者濃度分別控制在80~140 mg·L-1和140~200 mg·L-1之間能夠很好地保證發(fā)酵產(chǎn)量。
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