鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是危害魚類的主要的條件性病原菌之一，在世界各地流行，也是我國海水養(yǎng)殖魚類的重要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的危害[1,2]。鰻弧菌的致病性與許多毒力因子有關(guān)，除了由65 kb質(zhì)粒pJM1編碼的鐵吸收系統(tǒng)[3,4]、細(xì)胞外溶血毒素[5,6]、脂多糖[7]、細(xì)菌鞭毛蛋白[8,9]等毒力因子外，胞外蛋白酶也被認(rèn)為是鰻弧菌與其它許多細(xì)菌病原的毒力因子[10～16]。Milton等[14]首先從鰻弧菌 NB10中克隆了金屬蛋白酶基因，編碼 611個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，完整蛋白的分子量為 66.7 kDa。

陳吉祥等[15]從山東沿海養(yǎng)魚場(chǎng)發(fā)病魚分離的致病性鰻弧菌 W-1的胞外產(chǎn)物中分離純化了一種金屬蛋白酶，并在原核細(xì)胞中克隆、表達(dá)了該酶的基因——empA基因[17]，同時(shí)對(duì)其活性中心的氨基酸殘基進(jìn)行了定點(diǎn)突變[18]。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其序列同源性較高，活性位點(diǎn)氨基酸序列與其它病原弧菌有較大的相似度，不同血清型的鰻弧菌其活性中心的氨基酸殘基相同；活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變的金屬蛋白酶喪失其蛋白水解活性和細(xì)胞毒性，但仍具有較強(qiáng)的免疫原性，因此是一個(gè)頗具潛力的鰻弧菌疫苗候選抗原蛋白。

作者在此利用分子生物學(xué)技術(shù)將突變的鰻弧菌W-1金屬蛋白酶基因m-empA7克隆入真核表達(dá)載體中，使其在真核細(xì)胞中得到表達(dá)，為進(jìn)一步研究該疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的免疫效果以及研制鰻弧菌金屬蛋白酶基因疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

質(zhì)粒pET24d(+)/m-empA7、兔抗鰻弧菌W-1金屬蛋白酶抗體，自制；pCDNA3.1(+)、Trizol Reagent，Invitrogen公司；大腸桿菌JM109、真核細(xì)胞系CHO和HEK293T，中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院；ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、IPTG、各種限制性內(nèi)切酶、Wide Range DNA Ladder Marker、DNA凝膠回收純化試劑盒，大連寶生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，武漢博士德公司；除內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京天根生物工程有限公司；磷酸鈣法質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒，碧云天生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；MEM、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、D-Hank′s平衡液、胎牛血清和胰蛋白酶，Gibco公司；其它試劑均為國產(chǎn)生化試劑或分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)已突變的鰻弧菌W-1金屬蛋白酶基因m-empA7的堿基序列[18]及真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)多克隆位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(VP61：5′-CGGGATCCATGAAAAAAGTACAACGTCAA-ATG-3′,VP62：5′-CCGCTCGAGTTAATCCAGTC-TTAACGTTACACC-3′)。以pET24d(+)/m-empA7突變質(zhì)粒為模板，以VP61和VP62為引物，PCR擴(kuò)增得到5′和3′端分別帶有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的突變的金屬蛋白酶基因m-empA7。PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)分別用XhoI和BamHI雙酶切，回收純化后加T4 DNA連接酶于16℃連接16 h，氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coliJM109，挑取Amp抗性的單菌落鑒定，篩選陽性克隆，得到的重組真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pCDNA3.1(+)/m-empA7。酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。

1.2.2 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染

除內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA的提取方法按照Promega公司的除內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法按照碧云天生物工程有限公司的磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前24 h，通過胰酶消化收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基(含抗生素)將細(xì)胞平鋪于6孔板上，于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育20～24 h(細(xì)胞匯合度在70%～80%為宜)。轉(zhuǎn)染前30 min，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2 mL新鮮的不含抗生素的完全培養(yǎng)基。取2 μg待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，加入到100 μL CaCl2溶液中，混勻。均勻滴加DNA-CaCl2-BBS的混合物到整個(gè)6孔板內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻。在含3%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次以充分懸浮一些磷酸鈣沉淀。吸去含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液，加入2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染約36 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中m-empA7基因的轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，按Trizol Reagent說明書提取細(xì)胞中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)突變的金屬蛋白酶基因m-empA7的序列，在Genbank中進(jìn)行序列同源比對(duì)，選擇保守區(qū)段的第1485～1731核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(VP51：5′-CCTTTAACCAAGTGGGCGTA-3′，VP52：5′-CGATTTGTAAGGGCGACAAT-3′)，擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物為248 bp。以該引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測(cè)m-empA7基因的轉(zhuǎn)錄水平。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中m-empA7基因的表達(dá)產(chǎn)物

細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后收獲6孔組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞，分別加入上樣緩沖溶液，煮沸10 min，用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。然后用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，用含5%脫脂奶的PBST(含0.05% Tween20 1×PBS)4℃封閉過夜。以兔抗EmpA蛋白的多克隆抗體[17]作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，利用DAB進(jìn)行顯色，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中m-empA7基因的表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/m-empA7的構(gòu)建及鑒定

突變的鰻弧菌W-1金屬蛋白酶基因m-empA7經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，得到了約1.8 kb的片段(圖1)，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后插入到pCDNA3.1(+)中，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/m-empA7，經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后凝膠電泳，在1836 bp處有一目的條帶出現(xiàn)(圖2)。

M. DL2000 DNA Marker 1,2. m-empA7 Gene amplified by PCR

M1. λ-HindⅢ digest 1. pCDNA3.1(+) 2. pCDNA3.1(+)/m-empA7 3. m-empA7 Gene amplified by PCR M2. DL2000 DNA Marker

經(jīng)酶切鑒定的陽性重組質(zhì)粒由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行克隆片段的DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用http://www.ebi.ac.uk/clustalw/軟件與m-empA7的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證實(shí)它們的序列完全一致。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中m-empA7基因的轉(zhuǎn)錄

采用磷酸鈣法將重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/m-empA7轉(zhuǎn)染至CHO和HEK293T細(xì)胞中，同時(shí)以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)的細(xì)胞作空白對(duì)照、以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞作陰性對(duì)照，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，提取總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

M. 100 bp DNA Ladder marker 1. CHO Transfected with pCDNA3.1(+) 2. CHO Untransfected 3. CHO Transfected with pCDNA3.1(+)/m-empA7 4. HEK293T Transfected with pCDNA3.1(+) 5. HEK293T Untransfected 6. HEK293T Transfected with pCDNA3.1(+)/m-empA7

由圖3可看出，在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中都擴(kuò)增出了一條約248 bp的小目的片斷，說明m-empA7基因的mRNA在真核細(xì)胞中得到了轉(zhuǎn)錄。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞中均未擴(kuò)增得到目的片斷。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中m-empA7基因的表達(dá)

以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)的細(xì)胞作空白對(duì)照、以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞作陰性對(duì)照，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，收集細(xì)胞并裂解進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

1. CHO Transfected with pCDNA3.1(+) 2.CHO Untransfected 3. CHO Transfected with pCDNA3.1(+)/m-empA7 4. HEK293T Transfected with pCDNA3.1(+) 5.HEK293T Untransfected 6. HEK293T Transfected with pCDNA3.1(+)/m-empA7

由圖4可看出，在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中都檢測(cè)到了一條分子量約36 kDa的特異性免疫反應(yīng)帶，比由m-empA7堿基序列推測(cè)的蛋白質(zhì)分子量(66.7 kDa)小得多，這與在原核細(xì)胞中表達(dá)的情況相一致[17,18]，說明目的基因能夠在細(xì)胞內(nèi)正確轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)，并可與抗EmpA蛋白的抗體特異性結(jié)合。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞中未見有免疫反應(yīng)帶。

2.4 討論

DNA 疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(或RNA)，它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，被動(dòng)物宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性兩種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。早期DNA疫苗的研究主要是以哺乳動(dòng)物為模型，魚類DNA 疫苗的研究起步較晚。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大約有10%的養(yǎng)殖魚類死于傳染性疾病，而大規(guī)模的爆發(fā)性疾病會(huì)引起更嚴(yán)重的損失[19]。因此，開展魚類DNA疫苗的研究是非常必要的。1991年，Hansen等[20]首先報(bào)道了外源基因能夠在鯉魚肌肉組織中表達(dá)。1996 年，Anderson等[21]第一次報(bào)告了帶有IHNV糖蛋白基因的質(zhì)粒能夠在虹鱒中表達(dá)，并且能夠保護(hù)IHNV病毒對(duì)受免疫魚的感染。隨后的一些實(shí)驗(yàn)也證明，在多種魚體內(nèi)，外源基因不僅能夠高效、持久地表達(dá)，而且能夠引起宿主魚類對(duì)外源蛋白的免疫應(yīng)答。這些為構(gòu)建魚類DNA 疫苗提供了基礎(chǔ)。

病原菌的致病性是由一些可遺傳的毒力因子所決定，其中胞外蛋白酶被認(rèn)為是許多病原菌的一個(gè)重要毒力因子[10～16]。 不同弧菌胞外蛋白酶氨基酸序列保守性很高，且都具有活性位點(diǎn)，通過各自不同的方式發(fā)揮作用，致使受感染動(dòng)物發(fā)病或死亡，但同時(shí)這些毒素又是良好的抗原，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此常作為首選的疫苗抗原，在DNA疫苗中有較好的應(yīng)用。

作者所在研究組從鰻弧菌W-1中分離得到高活性的蛋白酶，通過對(duì)其理化性質(zhì)及末端氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白酶是一種金屬蛋白酶，由611個(gè)氨基酸殘基組成，完整蛋白的分子量為66.7 kDa[15]。對(duì)來源于不同養(yǎng)殖環(huán)境致病菌的蛋白酶基因進(jìn)行克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，其序列同源性較高，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)酶的可能活性位點(diǎn)氨基酸序列與其它病原弧菌有較大的相似度，不同血清型的鰻弧菌其活力中心的氨基酸殘基相同，但有關(guān)酶活性位點(diǎn)特定氨基酸殘基在維持酶活力和對(duì)細(xì)胞的毒性作用等方面，仍缺乏深入研究。

研究組在原核細(xì)胞中克隆、表達(dá)了鰻弧菌W-1金屬蛋白酶基因empA基因，并對(duì)其活性中心的氨基酸殘基進(jìn)行了定點(diǎn)突變?；钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將empA基因活性中心的Glu347突變?yōu)長(zhǎng)ys后，表達(dá)的突變蛋白m-EmpA7完全喪失了其蛋白水解活性和細(xì)胞毒性，但仍保持了其良好的免疫原性[18]，因此，可將沒有蛋白水解活性和細(xì)胞毒性的突變蛋白作為首選的疫苗抗原在真核細(xì)胞中表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行魚類鰻弧菌病DNA疫苗的研制。

3 結(jié)論

利用分子生物學(xué)技術(shù)，在已克隆的突變的鰻弧菌W-1金屬蛋白酶基因m-empA7的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了鰻弧菌突變金屬蛋白酶m-EmpA7的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/m-empA7，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng) RT-PCR和Western-blot檢測(cè)表明，m-empA7基因能夠在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而且表達(dá)的目的蛋白可與抗EmpA蛋白的抗體特異性結(jié)合，具有抗原性，因此，可考慮將pCDNA3.1(+)/m-empA7作為基因候選疫苗用于后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。這為進(jìn)一步研究鰻弧菌金屬蛋白酶基因疫苗在魚類弧菌病害防治中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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