甲殼素廣泛存在于海洋生物蟹、蝦的殼中和真菌的細(xì)胞壁中，其脫乙酰化產(chǎn)物殼聚糖是一種氨基多糖，具有良好的生物相容性和可降解性。殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中有大量氨基(或酰胺基)和羥基，能夠選擇性地螯合一些金屬離子，但是殼聚糖不溶于水，限制了它的應(yīng)用。為了改變其溶解性能，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，許多學(xué)者致力于其化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾研究[1～3]，得到不同取代度、不同取代位置的羧甲基殼聚糖，羧甲基殼聚糖對(duì)Cu2+、Zn2+、Ag+等金屬離子有較強(qiáng)的絡(luò)合能力[4～6]。作者以單氯乙酸為改性劑對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾，制備了N,N-二羧甲基殼聚糖 (N,N-Dicarboxymethylchitosan,DCMC)[7]及其鋅鹽(DCMC-Zn)、銀鹽(DCMC-Ag)、銅鹽(DCMC-Cu)，并考察了其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑和儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥94%,80目)，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；氯乙酸、碳酸鈉、無(wú)水乙醇、氯化鈉、硝酸銀、硝酸鋅、硫酸銅,均為分析純。

肉湯培養(yǎng)基：NaCl 0.025 g,蛋白胨0.50 g,牛肉膏0.15 g，蒸餾水50 mL。

大腸埃希氏菌、金黃色葡葡球菌均為青島科技大學(xué)藥學(xué)研究室提供。

DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，河南予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)，上海雷磁；FTIR8400型紅外光譜儀,日本島津；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RXZ智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠。

1.2 方法

1.2.1N,N-二羧甲基殼聚糖的合成

取1 g殼聚糖溶脹于100 mL水中，膨化24 h，慢慢加入4 g單氯乙酸，劇烈攪拌至殼聚糖全部溶解，混合均勻；在劇烈攪拌下逐滴加入10%的Na2CO3溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，得到均勻溶液；在90℃下反應(yīng)3 h，冷卻后過(guò)濾，濾出不溶物。濾液用1% HCl調(diào)pH值，析出沉淀，靜置，去除上清液，沉淀先用90%乙醇水溶液洗滌，再用無(wú)水乙醇多次洗滌，60℃下干燥，粉碎，得到淡黃色粉末，即N,N-二羧甲基殼聚糖。

1.2.2N,N-二羧甲基殼聚糖鋅、銀、銅鹽的制備

1.2.2.1N,N-二羧甲基殼聚糖鋅鹽的制備

在N,N-二羧甲基殼聚糖(0.40 g)的水溶液中加入0.06 g Zn(NO3)2,在pH值6.5、60℃條件下絡(luò)合反應(yīng)30 min，得到白色粉末絡(luò)合物，產(chǎn)物不溶于水和乙醇，也不溶于堿性溶液，可溶于稀酸。

1.2.2.2N,N-二羧甲基殼聚糖銀鹽的制備

磁力攪拌下，在N,N-二羧甲基殼聚糖(0.40 g)水溶液中加入0.50 g AgNO3反應(yīng)1 h，反應(yīng)液用丙酮結(jié)晶抽濾后，先以無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，直至無(wú)Ag+檢出，再用甲醇多次洗滌，于60℃真空干燥，得到褐色絡(luò)合物。

1.2.2.3N,N-二羧甲基殼聚糖銅鹽的制備[5]

稱取0.40 gN,N-二羧甲基殼聚糖溶于50 mL水中，攪拌均勻，另加入0.40 g CuSO4·5H2O于5 mL蒸餾水中溶解完全，攪拌下將硫酸銅溶液逐滴加入到均一的羧甲基殼聚糖溶液中，在30℃、pH值6.5下反應(yīng)2 h，得到藍(lán)色絡(luò)合物。

1.2.3 羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽的抑菌作用考察

將殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽加入到已配制好的肉湯培養(yǎng)基中，使加入物的濃度分別為100×10-6、200×10-6、400×10-6、600×10-6、800×10-6，然后按照麥?zhǔn)媳葷峁苁褂谜f(shuō)明加入3 mL細(xì)菌近似濃度為300×106個(gè)·mL-1的菌懸液培養(yǎng)，24 h后在600 nm下測(cè)定吸光度以判斷微生物的生長(zhǎng)狀況，以苯甲酸鈉作為對(duì)照，評(píng)價(jià)N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽的抑菌作用。

1.2.4N,N-二羧甲基殼聚糖等電點(diǎn)的測(cè)定[8]

取9份1.2.1取代反應(yīng)后的濾液20 mL，用10%HCl溶液分別調(diào)節(jié)其pH值至4.0、3.5、3.0、2.7、2.5、2.3、2.0、1.7、1.5，在231 nm處測(cè)定各溶液的透光率(T)。由于越接近等電點(diǎn)，N,N-二羧甲基殼聚糖的溶解性越差，導(dǎo)致其水溶液的透光率越小。因此，根據(jù)透光率-pH值曲線，確定產(chǎn)品的等電點(diǎn)。

1.2.5N,N-二羧甲基殼聚糖取代度的測(cè)定

精確稱取0.25 g干燥至恒重的N,N-二羧甲基殼聚糖于100 mL燒杯中,用25 mL 0.1 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液將其完全溶解后,用0.1 mol·L-1氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。同時(shí)用酸度計(jì)檢測(cè)溶液pH值的變化。利用二階導(dǎo)數(shù)法確定拐點(diǎn)處的堿用量。N,N-二羧甲基殼聚糖取代度(DS)依下式[9]計(jì)算：

DS=0.161A/(1-0.058A)

A=(V2-V1)c/m

式中:A為每克樣品中羧甲基的物質(zhì)的量,mmol;V1為滴定過(guò)量鹽酸的終點(diǎn)體積,mL;V2為滴定至RNH+(CH2COO-)2所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;m為樣品凈重,g；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析(圖1、圖2)

圖1 殼聚糖(a)和N,N-二羧甲基殼聚糖(b)的紅外光譜圖

由圖1可知，殼聚糖紅外圖譜中3437 cm-1處是N-H、O-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;2915 cm-1處為CH2上C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，另外2915 cm-1處的峰變寬可能是由于O-H和N-H基團(tuán)形成了氫鍵，兩振動(dòng)峰重疊所造成;1597 cm-1附近只有一個(gè)明顯的強(qiáng)吸收峰，歸屬于氨基的伸縮振動(dòng)[10],此處N-H的彎曲振動(dòng)峰證明了—NH2的存在;與脫乙酰度低的殼聚糖比較,1654 cm-1附近的二級(jí)酰胺中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰減少，說(shuō)明此全脫化殼聚糖的脫乙酰度高。

和殼聚糖相比，N,N-二羧甲基殼聚糖在1597 cm-1附近N-H彎曲振動(dòng)吸收峰減少，另外在3402 cm-1處存在較平的寬峰，尖峰的減少也說(shuō)明N-H吸收峰減少，說(shuō)明此處發(fā)生了N取代反應(yīng)；1735 cm-1處為-COOH中C=O的特征吸收峰；1637 cm-1處為-COONa中C=O特征吸收峰、羧酸基團(tuán)的C=O伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；1399 cm-1處為羧酸根上C-O伸縮振動(dòng)吸收峰；1240 cm-1處為N,N-二羧甲基殼聚糖中C-O-C的伸縮振動(dòng)吸收峰(殼聚糖環(huán)中O)；1068 cm-1處為C6位上羥基吸收峰和C-O伸縮振動(dòng)吸收峰。

圖2 N,N-二羧甲基殼聚糖銀鹽(c)、銅鹽(d)、鋅鹽(e)的紅外光譜圖

由圖2可知，絡(luò)合反應(yīng)前后，N,N-二羧甲基殼聚糖與DCMC-Zn、DCMC-Ag、DCMC-Cu的紅外譜圖最大的區(qū)別是N,N-二羧甲基殼聚糖1735 cm-1處吸收峰的消失，1637 cm-1處吸收峰DCMC-Zn、DCMC-Ag、DCMC-Cu分別移到了1609 cm-1、1587 cm-1、1635 cm-1,其余峰型無(wú)明顯變化，這說(shuō)明N,N-二羧甲基殼聚糖與Ag+、Cu2+、Zn2+的絡(luò)合反應(yīng)主要發(fā)生在COO-上。

2.2 N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點(diǎn)

在231 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同pH值下N,N-二羧甲基殼聚糖溶液的透光率，透光率隨pH值變化的曲線見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH值N,N-二羧甲基殼聚糖溶液的透光率曲線圖

透光率最低時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值即為等電點(diǎn)。由圖3可知，N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點(diǎn)為2.5。

2.3 N,N-二羧甲基殼聚糖的取代度

羧甲基殼聚糖的取代度一般以平均每個(gè)氨基葡萄糖(Glucosamine,GU)或N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine,AGU)單元上被羧甲基化的基團(tuán)數(shù)目來(lái)表示。通常情況下，羧甲基殼聚糖的取代度均小于2。取代度的大小直接決定了羧甲基殼聚糖的溶解性，取代度大于0.6的CM-CTS易溶于水[3]，隨著取代度的提高，其溶解性相應(yīng)加強(qiáng)，溶液的透明度也愈好。

圖4為N,N-二羧甲基殼聚糖的電位滴定曲線圖，其中pH=1.6所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)V1為過(guò)量HCl的滴定終點(diǎn)，pH=2.5為N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點(diǎn)，這與用分光光度法所確定的等電點(diǎn)一致。pH=4.7所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)V2為RNH+(CH2COO-)2的滴定終點(diǎn)。其中V1=9.0 mL、V2=27.0 mL，按照1.2.5方法測(cè)得N,N-二羧甲基殼聚糖的取代度為1.99。

圖4 N,N-二羧甲基殼聚糖的滴定曲線

2.4 N,N-二羧甲基殼聚糖及其鹽的抑菌作用

測(cè)定了殼聚糖、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，以苯甲酸鈉作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

由圖5可知，殼聚糖、苯甲酸鈉、DCMC-Cu、DCMC-Ag、DCMC-Zn、DCMC對(duì)大腸桿菌的抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)，其抑菌作用強(qiáng)弱依次為:DCMC-Ag>苯甲酸鈉>殼聚糖>DCMC-Zn>DCMC>DCMC-Cu；DCMC-Ag在濃度為100×10-6時(shí)的抑菌作用已經(jīng)明顯強(qiáng)于其它三者，這可能與Ag+本身有較強(qiáng)抑菌作用有關(guān)；殼聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌作用又強(qiáng)于N，N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銅鹽的抑菌作用,這與殼聚糖本身含有氨基、對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌作用有關(guān)；DCMC-Cu隨著濃度增大吸光度增加，表示其抑菌作用減弱，這可能與Cu2+濃度增大時(shí)顏色加深而影響吸光度的測(cè)定有關(guān)。

圖6 殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

由圖6可知,DCMC-Ag、DCMC-Cu、DCMC-Zn、DCMC、殼聚糖及苯甲酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)，其抑菌作用強(qiáng)弱依次為:DCMC-Ag>DCMC-Cu>苯甲酸鈉>殼聚糖>DCMC>DCMC-Zn；DCMC-Ag對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，其次是DCMC-Cu，DCMC-Zn最弱。DCMC-Ag在100×10-6時(shí)已表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌效果，DCMC-Cu抑菌效果僅次于DCMC-Ag，但明顯強(qiáng)于DCMC-Zn及DCMC。濃度為200×10-6時(shí)DCMC-Zn的抑菌作用強(qiáng)于DCMC，當(dāng)濃度超過(guò)300×10-6左右后DCMC-Zn的抑菌效果最弱。

3 結(jié)論

與殼聚糖相比，N,N-二羧甲基殼聚糖的水溶性增強(qiáng)，等電點(diǎn)為2.5，取代度為1.99，對(duì)Zn2+、Ag+、Cu2+都有很好的絡(luò)合作用。高取代度的DCMC對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌作用不如殼聚糖；DCMC-Ag對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用，且抑菌作用最強(qiáng)；DCMC-Cu對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果不明顯，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌卻有著明顯的抑制作用；DCMC-Zn對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌有抑制作用，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果不明顯。

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