楊 輝，周遠(yuǎn)大，何海霞

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥理教研室，重慶 400016）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）的發(fā)病率、病死率、致殘率均較高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命[1]。原發(fā)性腦出血時(shí)，出血后血腫的占位效應(yīng)及分解產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致周?chē)X組織腦血流下降、繼發(fā)性腦水腫、顱內(nèi)壓增高等連鎖反應(yīng)，使病情惡化。水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）是采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的雙功能嵌合蛋白，由重組中性粒細(xì)胞抑制因子（neutrophil inhibltory factor）、纖維蛋白的結(jié)合肽和水蛭素活性肽段嵌合，具有中性粒細(xì)胞抑制因子的功能和凝血酶的活性，由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥公司采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備而成。TNHH對(duì)大鼠動(dòng)脈阻塞性腦缺血損傷有明顯的保護(hù)作用[2]。本試驗(yàn)采用TNHH對(duì)腦出血大鼠進(jìn)行治療，觀察腦出血后大鼠腦含水量、神經(jīng)功能損傷與髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）之間的關(guān)系以及TNHH治療的效果，探討其治療作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：健康合格清潔級(jí)SD大鼠96只，雄性，體重180～230 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

儀器：動(dòng)物立體定位儀（上海第二軍醫(yī)大學(xué)）；BP61型電子分析天平（德國(guó)Sartorius）；VXH-3型微型漩渦混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；低溫醫(yī)用冰箱（日本SANYO）；Uvimini-1240型紫外分光光度計(jì)（日本SHIMADZU）；微量注射器（寧波市三愛(ài)儀器廠）；紅外恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)器械廠）。

主要試劑與藥品：注射用TNHH，由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥公司提供，系凍干制劑，規(guī)格為 3 mg/支，純度大于 95%，批號(hào)為20050401；部分凝血活酶活性時(shí)間（APTT）試劑盒，購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司；MPO測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥

將96只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、腦出血模型組（B組）、TNHH組（C組），每組32只，A組只進(jìn)針不注血。A組和B組靜脈注射等容量生理鹽水，C組靜脈注射TNHH 2 mg/kg。分別于造模前30 min及造模后每12 h給藥1次，于6，24，72，168 h時(shí)分別用Longa標(biāo)準(zhǔn)[3]測(cè)定神經(jīng)功能缺損。各組大鼠在處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，0級(jí)為無(wú)體征，記0分；Ⅰ級(jí)為動(dòng)物不能完全伸直其前肢，記1分；Ⅱ級(jí)為動(dòng)物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分；Ⅲ級(jí)為動(dòng)物不能站立、打滾，記3分；Ⅳ級(jí)為無(wú)自發(fā)性活動(dòng)，有意識(shí)障礙，記4分。評(píng)分在1～4分之間且取腦時(shí)可見(jiàn)腦內(nèi)血腫形成的大鼠入選實(shí)驗(yàn)組，表明腦出血模型制作成功。

1.2.2 模型制備

參照改良的自體尾動(dòng)脈血兩次注血法制作腦出血模型[4]。術(shù)后用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔，縫合頭部皮膚，整個(gè)過(guò)程采用無(wú)菌操作。大鼠清醒后無(wú)偏癱體征（Longa評(píng)分）或血液沿針道反流者棄用。A組操作與制作模型步驟相同，但不注血。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

腦含水量（干濕重法）：各時(shí)間點(diǎn)每組動(dòng)物處死后迅速取出全腦，置冰臺(tái)上，去除小腦和腦干。從進(jìn)針點(diǎn)將大腦冠狀位切成前后兩部分，前部腦組織留做HE染色，后部腦組織再?gòu)氖笭羁p切開(kāi)成左右兩半，分別稱(chēng)其濕重后，置100℃恒溫干燥箱24 h后稱(chēng)其干重。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

MPO：各組大鼠分別于不同時(shí)相點(diǎn)斷頭取腦，用4℃的冰鹽水沖洗干凈腦表面的血液，后用濾紙吸干凈，以進(jìn)針點(diǎn)作冠狀切面，取血腫周?chē)迈r腦組織200 mg，按照1∶9的比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS），冰浴下勻漿，4℃ 條件下3 000 r/min離心15 min后，取上清液，即為待檢樣品。測(cè)定MPO活性，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

APTT：在不同時(shí)相點(diǎn)Longa評(píng)分后，經(jīng)頸動(dòng)脈取血1.8 mL，迅速加入盛有0.2 mL的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液的硅化玻璃管中，輕輕顛倒混勻，3 000 r/min離心15 min，收集上層液體，測(cè)定APTT，以判斷TNHH對(duì)凝血功能的影響。

HE染色：將腦水腫測(cè)量剩余的進(jìn)針點(diǎn)前部腦組織用甲醛固定后石蠟包埋，切取片厚5 mm，常規(guī)HE染色，觀察水腫細(xì)胞形態(tài)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HE染色：光學(xué)顯微鏡下觀察，A組大鼠大腦各部分細(xì)胞排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)無(wú)水腫，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B組血腫周?chē)窠?jīng)元數(shù)目明顯減少，排列紊亂，基質(zhì)水腫明顯，細(xì)胞形態(tài)不完整，有大量炎性細(xì)胞及肥大變形的膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)；C組與同時(shí)相點(diǎn)B組比較，血腫周?chē)[帶及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等均有不同程度的改善。

神經(jīng)功能缺損評(píng)分：結(jié)果見(jiàn)表1。B組大鼠神經(jīng)功能缺損在24 h時(shí)最明顯，各個(gè)時(shí)相點(diǎn)顯著高于A組；C組大鼠各個(gè)時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)功能缺損均顯著低于B組，但仍高于A組。

腦含水量：結(jié)果見(jiàn)表1。B組大鼠腦含水量從6 h開(kāi)始逐漸增多，72 h達(dá)高峰，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時(shí)差異則不顯著；C組大鼠從6～72 h腦含水量與B組相比均顯著下降，168 h時(shí)差異則不顯著（P＞0.05），與A組比較無(wú)顯著性差異。

表1 各組大鼠不同時(shí)間觀察指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間觀察指標(biāo)比較（±s）

注：與 A 組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與 B組比較，□P＜0.05，■P＜0.01。

時(shí)間（h）神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分） 腦含水量（%） 腦勻漿MPO（MPO單位/g濕片） 血清APTT（s）A組B組B組C組C組A組B組C組A組B組C組6 24 72 168 A組 0 0 0 0 1.750±0.707 2.750±0.707 2.375±6.744 1.375±0.518 1.125±0.354□1.625±0.744■1.652±0.518□0.875±0.354□76.72±0.73■76.68±0.64■78.85±0.82■73.32±1.79 78.83±1.08▲79.78±1.30▲79.14±1.76▲77.72±2.02 77.57 ±0.85△□77.80±2.15△77.74±0.64△76.52±0.88 0.049±0.011□0.049±0.011■0.049±0.011■0.049±0.011 0.083±0.021△0.086±0.015▲0.089±0.007▲0.065±0.013 0.050±0.012□0.054±0.011■0.054±0.011■0.051±0.015 20.71±2.75□19.71±2.75■19.71±2.75■19.71±2.75 18.00±1.15△17.00±1.29▲16.29±1.51▲20.14±2.79 19.86±3.13 19.43±2.88 19.29±2.87□19.86±3.13

腦勻漿MPO：結(jié)果見(jiàn)表1。B組大鼠腦勻漿MPO從6 h開(kāi)始逐漸增多，72 h達(dá)高峰，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時(shí)差異則不顯著；C組大鼠從6～72 h腦勻漿MPO與B組相比均顯著下降，168 h時(shí)差異則不顯著，與A組比較無(wú)顯著性差異。

血清APTT：結(jié)果見(jiàn)表1。B組大鼠血清APTT值從6 h開(kāi)始逐漸縮短，72 h時(shí)最明顯，與A組大鼠相比有顯著性差異，168 h時(shí)差異則不顯著；C組大鼠血清APTT測(cè)定僅在72 h時(shí)與B組相比有顯著性差異，其余各觀察時(shí)間點(diǎn)與B組、A相比差異均不顯著。

3 討論

對(duì)于腦出血，目前臨床尚缺乏有效的防治手段，因此對(duì)出血性腦損傷的病理生理機(jī)制研究顯得尤為重要。本研究參照改良的自體尾動(dòng)脈血兩次注血法制作腦出血模型[4]，術(shù)后腦出血模型組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，腦含水量明顯增加，表明大鼠腦出血模型是成功的。

既往研究表明[5]，出血后腦損傷有多種機(jī)制，如凝血酶的毒性、血腫周?chē)[帶及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血腫分解產(chǎn)物、繼發(fā)性顱內(nèi)高壓等，其中前兩者尤為重要。凝血酶作為一種細(xì)胞外信號(hào)分子，介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用是通過(guò)其受體實(shí)現(xiàn)的[6]。急性腦出血后血液凝固過(guò)程中可釋放大量凝血酶，直接滲透或緩慢釋放到組織間隙，作用于局部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上凝血酶受體，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而這些炎性細(xì)胞因子促進(jìn)白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，從而加重炎性損傷。

中性粒細(xì)胞抑制因子可減少血腫周?chē)[帶中性粒細(xì)胞的積聚、滲出，減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和減少微血栓的形成，防止液體從血腦屏障滲出，從而有效減輕腦水腫，減輕神經(jīng)功能的損害[7]。水蛭素是凝血酶特異抑制劑，可直接減輕凝血酶的神經(jīng)毒性。本研究顯示，TNHH可明顯改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損體征，減輕腦出血后腦含水量和病理?yè)p害，降低急性腦出血后血腫周?chē)M織白細(xì)胞特征性成分MPO的活性，與腦出血模型組相比有顯著性差異（P＜0.01或 P＜0.05）?？梢?jiàn)，TNHH能明顯減輕腦出血后腦水腫，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

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