邴飛虹，張國斌，蘇彥奇

(湖北中醫(yī)學院中藥資源與中藥復(fù)方重點實驗室，湖北 武漢 430065)

蜈蚣三七系毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花 Anemone flaccida Fr.Schmidt的根莖，別名地烏，性溫，味辛、微苦，具有祛風濕、助筋骨、消腫止痛的功效[1]，民間常用于風濕疼痛、跌打損傷。本實驗室將蜈蚣三七有效部位中提取分離得到的總皂苷制成抗類風濕的中藥新藥[2]，目前已進入臨床研究階段。蜈蚣三七總皂苷的有效成分之一3－O－α－L－吡喃鼠李糖(1→2)－β－D－吡喃木糖－齊墩果酸－28－O－α－L－吡喃鼠李糖(1→4)－β－D－吡喃葡萄糖(1→6)－β－D－吡喃葡萄糖苷，由Zhao Li等[3]從蜈蚣三七中首先分離得到，本室定名為W3[4]，并研究證實W3在蜈蚣三七中含量最高[5－6]。筆者從蜈蚣三七中提取出W3，并比較了蜈蚣三七總皂苷、W3及其苷元齊墩果酸對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，為尋找免疫活性成分和進一步研發(fā)中藥新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及動物

Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Agilent Zorbax SB－C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);TS100－F－PH倒置熒光相差顯微鏡(日本尼康公司);AC100－110型酶標儀(瑞士TECAN公司)。D101大孔吸附樹脂(天津骨膠廠);薄層層析和柱層析硅膠G(100～200目，青島海洋化工廠)。胎牛血清(深圳達科為生物技術(shù)有限公司，批號為20061203);DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，批號為NRC0005)，加入胎牛血清配成體積分數(shù)為10%的完全培養(yǎng)液;淋巴細胞分離液(Axia－Shield公司，批號為 1002380，密度 1.077 g/mL);刀豆蛋白(ConA，Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(MTT，Amresco公司)，用DMEM培養(yǎng)液配成 0.5%的溶液，0.22 μm濾膜除菌;二甲亞砜(DMSO，Kehaoze公司)。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。蜈蚣三七采自湖北省五峰縣，經(jīng)湖北中醫(yī)學院中藥鑒定學教研室陳科力教授鑒定為林蔭銀蓮花 Anemone flaccida Fr.Schmidt的根莖。齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所);雷公藤片(三九黃石制藥廠，批號為 060401，每片含雷公藤甲素 33 μg)。W3、齊墩果酸、蜈蚣三七總皂苷均按W3計，雷公藤片按雷公藤甲素計，均以DMEM培養(yǎng)液配成所需濃度的溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后4℃保存?zhèn)溆?。昆明種小鼠，清潔Ⅱ級，雌雄各半，體重(20±2)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，合格證號為SCXK(鄂)2003－0005。

1.2 實驗方法

1.2.1 W3的制備

取蜈蚣三七粗粉1 kg，乙醇加熱回流提取，濾液于60℃減壓濃縮至棕色干浸膏。將此浸膏混懸于水中，加入水飽和的正丁醇萃取，提取液于80℃減壓濃縮至干，殘留物加水溶解，濾過，濾液上D101型大孔樹脂，水－乙醇系統(tǒng)洗脫，收集65%乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮至干，殘留物加甲醇溶解，加入丙酮使其沉淀完全，得蜈蚣三七總皂苷30 g。將此總皂苷以甲醇溶解，加入硅膠G混勻，干燥，按樣品∶硅膠G(1∶30)上硅膠干柱，氯仿－甲醇－水(20∶10∶1)系統(tǒng)洗脫，經(jīng)硅膠G板薄層原位酸水解法檢查，采用氯仿－甲醇－水(7∶4∶1)展開劑系統(tǒng)展開，顯色劑采用10%硫酸、105℃下加熱顯色。收集甲醇洗脫液，濃縮至干，濃縮物以60%甲醇溶解，用SBC18反相色譜柱進行制備分離，以乙腈－水系統(tǒng)洗脫，經(jīng)紫外檢測分離得白色無定形粉末W3，約80 mg。采用高效液相色譜法測定，W3純度為 93.25%。

1.2.2 脾淋巴細胞的制備與培養(yǎng)

脫頸椎處死小鼠，無菌制備單個脾細胞懸液，用培養(yǎng)液洗滌、懸浮沉淀，沿管壁緩緩加至淋巴細胞分離液上，離心，取液體中間層呈云霧狀的淋巴細胞，用培養(yǎng)液洗滌，以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液懸浮沉淀，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 靜止脾淋巴細胞的增殖試驗[7]

淋巴細胞培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，加入完全培養(yǎng)液至細胞含量107/mL。在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入細胞懸液 100 μL，培養(yǎng) 12 h 后，分別加入 100 μL 系列濃度(0.001，0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)的藥物，空白組加入等體積的 DMEM培養(yǎng)液，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，共培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄上清液，每孔加入 100 μL DMSO，在旋渦混合儀上振蕩5 min，酶標儀490 nm處檢測 A值。

1.2.4 ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細胞增殖試驗[7]

淋巴細胞培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，加入完全培養(yǎng)液至細胞含量107/mL。在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入細胞懸液 100 μL，培養(yǎng) 12 h 后，分別加入 50 μL 系列濃度(0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)的藥物，再加入 50 μL ConA(終質(zhì)量濃度 10 μg/mL)，空白組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，其他操作方法同1.2.3項下操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 對靜止脾淋巴細胞增殖的影響

結(jié)果見表1。各劑量的W3、齊墩果酸及蜈蚣三七總皂苷對靜止脾淋巴細胞的增殖均無明顯影響，與空白組比較均無顯著性差異(P＞0.05);高劑量(≥10 μmol/L)雷公藤片則對靜止脾淋巴細胞的增殖有明顯抑制作用，與空白組比較差異顯著(P＜0.05)。

表1 各種質(zhì)量濃度的不同藥物對靜止淋巴細胞增殖的影響(X ± s，n=4)

表2 各種質(zhì)量濃度的不同藥物對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖的影響(X ± s，n=4)

2.2 對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖的影響

結(jié)果見表2。各劑量的齊墩果酸對淋巴細胞增殖均無明顯影響;當劑量不小于0.1 μmol/L時，W3對淋巴細胞增殖表現(xiàn)出較強的抑制活性(P＜0.05);當劑量不小于1 μmol/L時，蜈蚣三七總皂苷及雷公藤片對淋巴細胞增殖均有抑制作用(P＜0.05)。

3 討論

對蜈蚣三七總皂苷的含量測定研究表明，W3為蜈蚣三七的代表性成分，含量約占總皂苷的27.5%。關(guān)于蜈蚣三七有效成分的免疫活性，國內(nèi)外尚未見文獻報道。本研究通過比較蜈蚣三七總皂苷、W3及其苷元齊墩果酸對小鼠體外脾淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響，首次探討了蜈蚣三七有效成分W3的免疫活性。

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，機體免疫應(yīng)答過程中T淋巴細胞的過度激活、增殖和浸潤，加重了關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和滑膜組織增生。通常淋巴細胞增殖反應(yīng)被認為是反映機體免疫功能的有效指標之一。脾淋巴細胞中含有T淋巴細胞和B淋巴細胞，ConA作為T淋巴細胞有絲分裂原，主要促進T淋巴細胞增殖。因此采用ConA刺激法來研究蜈蚣三七有效成分W3的免疫活性。結(jié)果顯示，較高劑量的W3對靜止淋巴細胞未產(chǎn)生毒性反應(yīng)，而對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖活性有顯著的抑制作用，這與其在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎中抑制T細胞增殖、調(diào)節(jié)機體免疫機能的功用一致。蜈蚣三七中大多皂苷類成分的苷元均為齊墩果酸，二者的理化性質(zhì)亦相似。本研究中，齊墩果酸對靜止態(tài)及ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖均無明顯影響，說明苷元不連接糖基則無抑制或促進淋巴細胞增殖的作用。

可見，蜈蚣三七總皂苷及有效成分W3的免疫調(diào)節(jié)作用特點在于對正常機體的免疫功能無明顯影響，對已處于免疫激活狀態(tài)的機體則有顯著的抑制作用，且具高效、低毒的優(yōu)點[8－10]，預(yù)示W(wǎng)3具備了較強的免疫活性和深入開發(fā)的潛力，但對免疫系統(tǒng)的作用機理尚待進一步研究。

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社，2002:802.

[2]邴飛虹，張國斌.國家五類新藥——地烏風濕安膠囊[J].湖北中醫(yī)雜志，2005，27(1):48－49.

[3]Zhao L，Chen WM，F(xiàn)ang QC.Two new oleanane saponins from anemone flaccida[J].Planta Medica，1991，57(6):572 － 574.

[4]邴飛虹，韓林濤.從林蔭銀蓮花提取的地烏皂苷W3標準品及制備工藝:中國，CN200510018363.9[P].2005 －10－19.

[5]邴飛虹，易艷東，張國斌.蜈蚣三七有效成分W3單次給藥后在小鼠體內(nèi)的藥代動力學研究[J].中國藥科大學學報，2006，37(6):523－526.

[6]邴飛虹，易艷東，張國斌.林蔭銀蓮花總皂苷中W3在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究[J].中國藥理與臨床，2009，25(1):23－25.

[7]苗明三.大棗多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL－1α及脾細胞體外增殖的影響[J].中藥藥理與臨床，2004，20(4):21－22.

[8]江 俊.地烏總苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠特異性免疫功能影響的實驗研究[J].中藥材，2002，25(3):194 －195.

[9]邴飛虹，張國斌，鄧成志.蜈蚣三七提取物對膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠病理改變的影響[J].湖北中醫(yī)學院學報，2008，10(2):3－5.

[10]邴飛虹，張國斌，鄧成志，等.蜈蚣三七提取物對小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎免疫作用機理的初步研究[J].中國免疫學雜志，2008，24(8):716－720.